人骨髓间充质干细胞分化为运动神经元过程中Nestin与Hb9表达的研究

张振山 王春芳＊ 胡风云 李鹏飞 张海滨 李 宵

（1山西医科大学实验动物中心，太原030001；2山西省人民医院，太原030001；3山西医科大学科研实验中心，太原030001）

干细胞移植在临床上治疗运动神经元退行性疾病有着很好的应用前景，为临床治疗脊髓损伤类疾病带来了新的理念性革命［1］。作为干细胞领域的研究热点，骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一类具有细胞来源广、体外增殖能力强、免疫原性低且不存在伦理争议的干细胞［2－3］，在体外已经被成功诱导为软骨、成骨、皮肤、神经等多种细胞［4－5］。因此深入研究骨髓间充质干细胞定向向运动神经元（motor neuron，MN）方向分化可以为神经再生领域提供理想的种子细胞。Nestin为神经干细胞（neural stem cells，NSCs）的特异性标记物［6］，Hb9为运动神经元的特异性标记物［7］，通过对该两项基因的检测，可以对骨髓间充质干细胞向运动神经元分化的过程有更为清晰的认识。本文旨在通过检测Nestin与Hb9表达的变化来探讨人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs）在维甲酸（retinoic acod，RA）、音猬因子（sonic hedgehog，Shh）等因素的干预下向运动神经元分化的过程，从而为运动神经元最终走向临床治疗脊髓损伤提供更为详尽的数据与理论支持。

材料和方法

1．主要试剂及仪器

DMEM 粉末（Gibco）、DMEM／F12（Gibco）、胎牛血清、六孔板，超净工作台，CO2培养箱（Thermo Forma），Stepone Plus PCR扩增仪（ABI），倒置显微镜（OLYMPUS），荧光显微镜（OLYMPUS）

2．标本来源

取自山西省人民医院需骨髓穿刺但证实非血液病患者的骨髓血，且实验已获得经患者本人或其家属签署的知情同意书。

3．hBMSC的分离培养及鉴定

取所抽取的骨髓血梯度离心后取中间层与少量培养基混匀，接种于六孔板内贴壁4小时后加满培养基，3天后全量换液，之后每3天换液逐步洗去未贴壁的红细胞，并定期于倒置显微镜下观察细胞生长状况及拍照。待细胞传至第三代时，取生长状况良好的一板细胞做CD44、CD45免疫细胞化学鉴定。

4．hBMSC分组诱导

取三板传代至第三代的生长状况良好的细胞分为三组。第一组为诱导分化组，将含10%胎牛血清的DMEM培养基更换为不含胎牛血清，含RA浓度为5μmol／L的DMEM／F12培养基（辅助添加适当浓度的bFGF、Shh因子）；第二组为自然分化组，将含10%胎牛血清的DMEM培养基更换为含1%胎牛血清的DMEM／F12培养基；第三组为空白对照组，继续使用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养。按照以上三组处理后继续培养3天。

5．免疫细胞化学染色

取传至第三代细胞接种于预先放置盖玻片的六孔板中，取三板细胞按照以上分组处理并培养3天，0．01MPBS洗去培养基后4%多聚甲醛固定30分钟，双蒸水洗三次，0．3%Triton、山羊血清室温条件下封闭30分钟后分别各加入Nestin、Hb9小鼠抗人血清（Abcam，1∶100稀释），4℃过夜后加入FITC标记的山羊抗小鼠二抗（Abcam，1∶2000稀释），室温条件下孵育1．5小时，最后加 Hoechst 33342（invitrogen，1∶2000稀释）染核30分钟后荧光显微镜下观察拍照。

6．检测Nestin、Hb9基因表达

采用 Ambion miRNA Isolation Kit试剂并按照其试剂说明书提取以上三组的总RNA．逆转录反应体系中含 RNA（100ng／μl）、Olig（dt）18Primer（50μM）、RNase free dH2O，70℃保温10分钟后冰上冷却2分钟以上，之后加入5×M－MLV Buffer，dNTP Mixture（10mM）、RNase Inhibitor（40U／μl）、RTase M－MLV（200U／μl），42℃保温1小时，70℃保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA保存于－20℃以下的环境备用。引物采用 ABI Primer express3．0软件设计，本实验所涉及引物序列为：

Gene Primers sequences（5’－3’）Hb9 Forward：CCCACAGTGTTACCTGACTTATGAAA Reverse：GACCCCAGAGACGTAAGCATAAAC Nestin Forward：AGCCCTGACCACTCCAGTTTAG Reverse：CCCTCTATGGCTGTTTCTTTCTCTAC RPL－19Forward：TGGCAAGAAGAAGGTCTGGTTAG Reverse：GACGGGAGTTGGCATTGG

PCR扩增采用 ABI Stepone Plus定量PCR仪，具体20μl反应液组成为：SYBR Select Master Mix 10μl，PCR引物0．6μl，ddH2O 9μl，cDNA 产物0．4μl，每孔设置2个重复，以 RPL－19为内参，扩增条件为：50℃2分钟，95℃2分钟，之后95℃15秒，58℃30秒，72℃1分钟循环40次，分析采用比较CT值法，应用 Applied Biosystems StepOneTMReal－Time PCR System Software所提供的 Study软件进行相对定量分析。

7．统计学处理

实验数据实验数据用均数±标准差（¯x±s）表示，采用SPSS13．0统计分析软件进行t检验分析。

结 果

1．hBMSC形态学观察及鉴定结果

原代培养3天后全量换液，可见少数呈梭形的单个贴壁细胞，分布不均匀，第二、三次换液可见原有的单个细胞逐渐集落生长，10天左右开始大量增多。传代细胞生长更为迅速，分布均匀，形态纤长，细胞聚集到一定程度时可见漩涡状。经免疫细胞化学鉴定，该梭形细胞99%以上为CD44阳性表达，CD45几乎全为阴性表达。

2．不同分组的hBMSC形态学观察

传代至第三代的hBMSC经RA诱导后，纤长的两极明显回缩，呈椭圆形或圆形细胞明显增多，部分细胞可见有明显的突起。自然分化组虽也有一定比例的此类细胞形成，但明显低于诱导分化组。空白组未发现有显著形态变化。

3．免疫细胞化学染色结果

经免疫细胞化学鉴定发现，诱导分化组显示的Nestin、Hb9阳性表达率均明显高于其它两组，其次表达率高的为自然分化组，空白组Nestin、Hb9阳性率表达均为最低。

4．PCR扩增结果

根据PCR扩增曲线可知：三组细胞中，经过RA、Shh诱导的hBMSC其Hb9、Nestin基因表达显著增高，其次为自然分化组，空白对照组该基因表达为三组最低，且三组之间该两种基因的表达均相互存在统计学差异（P＜0．05）。

讨 论

体外诱导胚胎干细胞向运动神经元分化已经成为现阶段学术界研究的重大热门，但其所存在的致瘤可能以及免疫排斥也几乎成为制约运动神经元最终走向临床治疗脊髓损伤类疾病的重大瓶颈［8－9］。相对于胚胎干细胞而言，非神经源性的骨髓间充质干细胞具有来源广泛且不存在伦理争议、体外培养时增殖能力强、低免疫原性等多方面的优点［10－11］。

Wislet－Gendebien S等通过研究认为，BMSC向神经元方向分化是一个逐步的过程，先是将其诱导为Nestin阳性的细胞，进而将Nestin阳性的BMSC诱导为各类成熟的神经元［12］。已有研究表明，RA可以与神经营养因子－3（Neurotrophic factor－3，NT－3）联合作用启动 TrkC 的途径促进BMSC向 NSCs方向转化［13］。

Shh作为三种分泌蛋白（Ihh，Dhh和Shh）家族中的一员，在神经发育过程中起重要和关键性作用。Tanabe Y等通过研究发现，脊索分泌的Shh蛋白是诱导体内MN分化的必需条件，由此推断Shh信号通路参与了对体内 MN分化的管控［14］。据此我们推测出体外Shh可能有诱导BMSCs向胆碱能样神经元定向分化的作用。

Nestin是一种表达在神经上皮干细胞的中间丝蛋白，在发育过程中逐渐被特定的神经元或神经胶质丝代替，是神经干细胞的特异性标记物。在中枢神经系统的发育过程中，Hb9被选择性表达在运动神经元的形成过程中，Nakano T等的研究提到仅需增强小鼠Hb9基因中一个9－kb 5V片段的表达即可直接使其脊髓运动神经元在体内的表达大幅上调［7］，可以特异性地将其作为运动神经元的标记物。

实验通过对Nestin与Hb9两个基因的检测重点探讨了人类骨髓间充质干细胞在RA及Shh的诱导下定向向神经干细胞乃至运动神经元分化的过程。通过探讨以上分组中这两个基因的表达，我们发现，由于人骨髓间充质干细胞所具有的多向分化能力，在正常未加任何诱导剂的情况下，有一定比例的人骨髓间充质干细胞会自发向神经干细胞乃至运动神经元方向分化，但也正是因为其所具有的该干细胞特性，也可能有一定比例的hBMSC向其它方向发生了转化，也就从侧面证实了人骨髓间充质干细胞分化的多向性。

其次，通过以上免疫细胞化学检测及PCR结果可知，诱导分化组Nestin与Hb9的阳性表达率显著高于自然分化组与空白对照组该两项基因的表达率，由此可见，RA与Shh的诱导确实有效加强了hBMSC向神经干细胞乃至运动神经元转化的趋势。

最后，通过仅对诱导分化组与空白组两个组中Nestin、Hb9这两个标志性基因的比较来看，Nestin表达诱导组仅为空白组的5倍多（5．25），而Hb9表达诱导组已将近为空白组的120多倍（122）。结合BMSC向MN分化的阶段性特征，可以推测，在Shh靶向作用的引导下，已经有大量的hBMSC经RA诱导为Nestin阳性的NSC后在Shh的辅助作用下又被诱导为Hb9阳性的MN。

在此需要提到的是，邓镇、姜晓丹等也曾用小鼠骨髓基质细胞经过不同分组处理后，采用SABC免疫细胞化学和间接免疫荧光法分别检测了Nestin与Hb9的表达量［15］，所不同的是本实验是通过直接分离并培养得到了人的骨髓间充质干细胞，在种属来源方面与临床运用的范畴具有一致性，可以直接为干细胞治疗脊髓损伤类疾病提供可靠的细胞来源及数据支持。其次本实验除运用免疫细胞化学这一在体检测手段外，也进一步运用了荧光定量PCR法检测了两个标记基因，可能也正是由于检测手段的不同，本实验发现空白对照组及自然分化组也有少量的Hb9阳性表达，提示存在极少比例的hBMSC在未经诱导的条件下自发向MN方向发生了分化。

综上所述，我们的研究表明了人骨髓间充质干细胞具有向神经干细胞乃至运动神经元分化的潜能，也进一步证实了RA与Shh的诱导能够有效促使hBMSC最终分化为运动神经元的可行性。此次实验研究有利于阐明hBMSC向神经元样细胞分化的调控机制，也提示我们今后可以通过施加RA与Shh对hBMSC的处理后，将其移植于脊髓损伤模型小鼠的受损部位，进而从行为学上判断运动神经元比例增加后对模型小鼠功能恢复的改善作用，以期为hBMSC移植最终应用于临床上治疗脊髓损伤类疾病提供更为全面的数据与实验支持。

图 版 说 明

图1 第三代hBMSC CD44表达为阳性。A：细胞核用Hoechst33342染为蓝色。B：绿色所示为CD44表达阳性细胞。

图2 诱导分化组细胞形态发生变化，细胞胞浆回缩，有神经元样细胞出现。A：诱导分化组细胞有神经元样细胞出现。B：细胞胞浆回缩，伸出突起。

图3 诱导分化组可见Nestin表达为阳性的细胞。A：细胞核用Hoechst33342染为蓝色。B：绿色所示为Nestin表达阳性细胞。

图4 Nestin与Hb9的PCR扩增曲线。A：Nestin扩增曲线（1：a Nestin；2：b Nestin；3：c Nestin；4：a RPL－19；5：b RPL－19；6：c RPL－19）。B：Hb9扩增曲线（1：a Hb9；2：b Hb9；3：c Hb9；4：a RPL－19；5：b RPL－19；6：c RPL－19）。（a：诱导分化组；b：自然分化组；c：空白对照组）

图5 Nestin与Hb9相对定量结果。A：Nestin相对定量结果（a：诱导分化组；b自然分化组；c：空白对照组）。B：Hb9相对定量结果（a：诱导分化组；b自然分化组；c：空白对照组）。

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1The hBMSCs at passage three were immunoreactive to CD44．A：Cell nuclei were counterstained blue by Hoechst33342．B：CD44positive cells were green．

Fig 2The morphology of hBMSCs had changed in the differentiation group．The cell cytoplasm retracted，looked like neuron－like cells．A：The neuron－like cells appeared in the differentiation group．B：The cell cytoplasm retracted，stretched process．

Fig．3The Nestin positive cells showed in the differentiation group．A：Cell nuclei were counterstained blue by Hoechst33342．B：Nestin positive cells were green．

Fig．4The PCR amplification cure of Nestin and Hb9．A：PCR amplification of Nestin（1：a Nestin；2：b Nestin；3：c Nestin；4：a RPL－19；5：b RPL－19；6：c RPL－19）．B：PCR amplification of Hb9（1：a Hb9；2：b Hb9；3：c Hb9；4：a RPL－19；5：b RPL－19；6：c RPL－19）．（a：induction and differentiation group；b：natural differenti－ation group；c：control group）

Fig．5The relative quantitative results of gene Nestin and Hb9．A：The relative quantitative results of gene Nestin（a：induction and differentiation group；b：natural differentiation group；c：control group）．B：The relative quantitative results of gene Hb9（a：induction and differentiation group；b：natural differentiation group；c：control group）．

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