Ezrin在胃癌组织中的表达及与Hp－L型感染关系的探讨

于兴燕 于东红＊ 杨景欣

（1蚌埠医学院第一附属医院病理科，蚌埠医学院病理学教研室，安徽233004；2山东省枣庄市峄城区中医院内科，枣庄277300）

胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其浸润和转移是决定预后的关键因素，故研究胃癌的浸润与转移的分子机制具有重要意义。Ezrin（埃慈蛋白）又称细胞绒毛蛋白，为膜－细胞骨架蛋白连接蛋白，与根蛋白、膜突蛋白共同构成ERM蛋白家族［1］。他们在胞质中起交叉连接膜与肌动蛋白骨架的作用，从而在细胞的移动和细胞形态发生中起着重要的作用［2］。Ezrin具有调节细胞骨架肌动蛋白，调整细胞形状、粘附和活性，参与信号转导途径等功能［3］。幽门螺杆菌是引起慢性胃炎、胃溃疡、胃黏膜相关淋巴瘤（MALT）的主要致病菌，并与胃癌的发生直接相关，被WHO定为一级致癌物［4］。它在不利于其生长繁殖的环境中易发生细胞壁缺陷而形成幽门螺杆菌L型（Helicobacter pylori L－form，Hp－L），目前国内外对Hp－L感染与胃癌关系的研究较少，其感染在胃癌发生发展过程中的作用尚不清楚［5］。本实验通过对胃癌组织及正常胃粘膜组织中Hp－L感染和Ezrin蛋白、mRNA表达的检测，探讨Ezrin及Hp－L型在胃癌浸润转移中的作用及二者的关系。

材料和方法

1．标本

（1）收集2010年1月至2011年10月间，蚌埠医学院第一附属医院病理科存档的胃癌手术切除组织蜡块80例。所有蜡块经重新切片复查，术前未经任何抗癌治疗。其中男性50例，女性30例，年龄36～80岁，中位年龄58岁。根据2003年世界卫生组织肿瘤分类及诊断标准（WHO，2003版）又将该组病例分为低分化30例、中分化21例、高分化29例；根据国际抗癌联盟（UICC）公布的TNM分期标准（2002年，第6版）将该组病例分为Ⅰ期15例、Ⅱ期13例、Ⅲ期25例、Ⅳ期27例；浸润至浆膜的60例，未浸润至浆膜的20例；有淋巴结转移的60例，无淋巴结转移的20例在该组病例中，随机选取40例胃癌两端切缘组织作为正常对照组，标本经病理组织学证实。所有标本经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，4μm连续切片，做HE染色、革兰染色及免疫组织化学染色。（2）收集2012年2月至2012年5月蚌埠医学院第一附属医院胃癌手术切除的新鲜组织标本30例及其相应的新鲜的远端正常组织（距肿瘤边缘组织约5cm处），患者术前均未经过放、化疗治疗。所有胃癌及远端正常组织均在离体30min内切取，迅速放入液氮中，然后移入－80℃冰箱保存。其中男性16例，女性14例，年龄45－72岁，中位年龄58岁，患者临床资料完整，病理资料重新经过2名病理主治医师复习，随后按2003版的WHO中胃癌组织学分级标准进行组织学分级。根据国际抗癌联盟（UICC）公布的TNM分期标准（2002年，第6版）进行分期。

2．方法

2．1Hp－L型检测

组织切片经革兰染色油镜（×1000）观察并计数，每例随机观察10－15个不同视野，取其平均数，L型和Hp均数≥20为阳性，＜20或未查见L型和Hp为阴性。革兰染色阴性呈红色，阳性呈紫红色。L型形态多样，大小不等，有巨形体、圆球体、短杆状等，革兰染色一般为阴性，少量表现为阳性（由于细胞壁的缺陷，L型增加了对结晶紫的亲和力，故革兰染色有的呈现紫红色即革兰染色阳性）。Hp呈螺旋形、“S”形或海鸥形，革兰染色为阳性。每例同时用抗Hp－L抗体（蚌埠医学院微生物教研室制备）进行免疫组织化学Elivision法染色，工作浓度为1∶100。用已知Hp－L型阳性切片作为阳性对照，PBS替代一抗作为阴性对照，其余按说明书操作。胃癌细胞、正常胃黏膜上皮细胞及间质巨噬细胞的胞质或胞膜着棕黄色细颗粒为Hp－L型抗原表达阳性。革兰染色L型检出和免疫组化Hp－L型抗原表达同时阳性者定为Hp－L型感染阳性。

2．2Ezrin检测 （1）免疫组织化学Elivision法：Ezrin鼠抗人单克隆抗体及Elivision试剂盒均购自福州迈新生物技术有限公司，按试剂盒说明书操作，PBS替代一抗作阴性对照，已知阳性片作阳性对照。（2）逆转录多聚酶链反应（RT－PCR）法：Ezrin、β内参引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成。Trizol Reagent（Invitrogen）、逆转录试剂盒、Marker、DEPC（Sigma）、琼脂糖、TBE等购自合肥志宏生物技术有限公司。①总RNA提取：取－80℃冰箱内存放的新鲜组织50μg，加Trizol研磨并按试剂盒说明操作，提取总RNA。用紫外分光光度仪 A260／A280检测部分总 RNA，测得 OD260／OD280比值在1．8－2．0之间者，－80℃冰箱存储备用。②逆转录合成cDNA：严格按照说明书的操作步骤进行操作，反应产物最终体积为20μl。③聚合酶链反应（PCR）：Ezrin基因上游引物5′－AAG GAG AGA AAC CGT GGA GAG－3′，下游引物5′－GTG CTG CCA CTC TTC AAC TTC－3′。β－actin上游引物5′－CTGGGACGACATGGAGAAAA－3′，下 游 引 物5′－AAGGAAGGCTGGAAGAGCGC－3′。 反 应 条件：95℃5min，94℃45s变性，Ezrin退火温度57．7℃，β－actin退火温度为55．6℃，各进行45s，72℃延伸45s，反应35个循环，最后一轮延伸7min。预期Ezrin扩增产物大小为358bp，β－actin扩增产物大小为564bp。

2．3结果判定 （1）免疫组化：Ezrin蛋白在胞质内表达，呈棕黄色颗粒。以1000个肿瘤细胞计数，阳性细胞数＜5%为（－），5%～25%为（＋），＞25%～50%为（＋＋），＞50%为（＋＋＋）［6］。（2）RTPCR：配制2%琼脂糖凝胶放入电泳槽中，加入500ml×TBE。加样：Mark5μl加入一孔中，PCR产物5μl＋0．25%溴化乙锭（EB）1μl混匀后另外孔内，接好电源，电泳（电压按100V，电流60mA）30min。结果在GIS凝胶图像处理系统中拍摄记录，并使用图像分析软件行灰度扫描作半定量分析。

2．4统计学方法 应用SPSS17．0统计软件对实验数据进行统计分析。计数等级资料采用独立样本t检验、卡方检验和Spearman秩相关检验，以α＝0．05为差异有统计学意义的界值。

结 果

1．Hp－L型检测结果

（1）观察革兰染色切片发现，L型主要分布在胃癌癌巢、癌细胞胞浆、腺腔及间质巨嗜细胞的胞质内。癌巢的坏死处几乎无L型，正常组织内少见。形态呈多形性，有巨形体、圆球体、原生小体等。多粘附于癌细胞及胃粘膜上皮细胞表面（图1）。胃癌组中有64例革兰染色检出L型，仅10例同时检出L型和Hp，检出率分别为80．00%（64／80）、12．50%（10／80）；免疫组化 Hp－L型抗原表达阳性率为81．30%（65／80，图2）；与革兰染色L型检出的阳性率具有一致性（P＞0．05）；80例胃癌组织中 Hp－L型阳性（即革兰染色L型检出阳性和免疫组化Hp－L型抗原表达同时阳性）的病例数为56例，其阳性率为70．00%；对照组中有9例革兰染色同时检出Hp和L型，免疫组化Hp－L型抗原表达阳性为16例，两种方法检测同时阳性（即 Hp－L型阳性）的有9例，阳性率为22．50%（9／40），Hp检出阳性率为22．50%（9／40），经统计学处理两种方法Hp－L型检出率无统计学意义（P＞0．05，表1）。

胃癌组与对照组Hp－L型感染阳性率差异有统计学意义（P＜0．05，表2）。

表1 两种方法Hp－L检查结果比较Table 1 Two methods of Hp －L inspection result comparison

表2 不同组织中Hp－L检测情况Table 2 The result of Hp－L detected in different gastric tissues

（2）比较Hp－L型感染阳性率与胃癌临床病理因素的关系发现，Hp－L型感染阳性率仅与淋巴结转移有关（P＜0．05），与胃癌细胞的分化程度、浸润深度、肿瘤的临床分期、患者的年龄和性别均无关（P＞0．05，表3）。

表3 胃癌中Hp－L型感染与临床病理因素的关系Table 3 The relationship of Hp－L infection and clinical pathologic factors in gastric carcinom

2．胃癌组织中Ezrin蛋白及其mRNA的表达及意义

（1）免疫组化结果：从表4可见胃癌组织中Ezrin蛋白的表达阳性率为66．25%，对照组为26．00%，经卡方检验，Ezrin蛋白在胃癌组和对照组的阳性表达率差异具有统计学意义（P＜0．05）。

表4 不同组织中Ezrin蛋白表达情况Table 4 The expression of Ezrin protein in different tissues

Ezrin在组织中表达情况如图3、4。

比较Ezrin蛋白表达阳性率与胃癌临床病理因素的关系发现，Ezrin蛋白表达阳性率与胃癌细胞的分化程度、浸润深度及淋巴结转移有关（P＜0．05），而与肿瘤的临床分期、患者的年龄和性别无关（P＞0．05）。

（2）RT－PCR 结果：用β－actin内参（564bp处）和DNA标准分子量标记物（DNA Marker）作为参照和标尺，在凝胶成像仪下观察可见，胃癌组和对照组中均有扩增的Ezrin条带（358bp处），不同的是，胃癌组的条带亮度较对照组高（图5）。对30例胃癌患者的Ezrin／β－actin电泳条带吸光度比值进行统计学分析，由表6可见，胃癌组中Ezrin mRNA的表达明显高于对照组，二者差异具有统计学意义（P＜0．05）。

表5 胃癌中Ezrin表达与临床病理因素的关系Table 5 The relationship between Ezrin expression and clinical pathologic factors in gastric cancer

表6 Ezrin mRNA在胃癌组及对照组中的表达Table 6 The expression of Ezrin mRNA in gastric carcinoma and normal controls

3．胃癌的Hp－L型感染与Ezrin蛋白表达的关系

从表7可见胃癌组Hp－L型阳性组的Ezrin表达阳性率高于其阴性者，经Spearman等级相关分析发现，胃癌组Ezrin阳性表达与Hp－L型阳性感染具有正相关性（r＝0．456，P＜0．05）。

表7 胃癌组Ezrin蛋白表达与Hp－L型感染的关系Table 7 The relations of Ezrin protein expression and Hp －L infection in gastric cancer group

讨 论

侵袭和转移是恶性肿瘤的主要生物学特性。肿瘤细胞在转移过程中存在细胞骨架及细胞黏附分子的改变，从而使肿瘤细胞摆脱细胞间黏附作用的控制，脱离原发灶而发生转移［7］。Ezrin通过与细胞粘附分子的相互作用，调节细胞－细胞和细胞－细胞外基质的黏附，参与肿瘤信号转导途径和肿瘤吞噬等机制，影响肿瘤转移［8－10］。Ezrin分子的 C端与 N端能够发生分子内的相互作用，进行自身分子内交联，产生一个头尾相连的闭合静止构象。这种构象使得Ezrin与膜蛋白及肌动蛋白的结合位点被掩盖起来，不能发挥其作用而维持在失活状态。Ezrin可以通过一系列活化信号解除这种抑制机制而达到活化状态［8］。活化的Ezrin的C－末端与细胞骨架的肌动蛋白相连，N末端则可通过与细胞表面的粘附分子cadherin、CD44等连接，调节细胞－细胞及细胞－细胞外基质之间的黏附，从而影响肿瘤细胞的侵袭性等生物学行为［12］。本研究显示Ezrin在正常胃组织中呈低表达（26%，13／40），而在胃癌组织中呈高表达（66．25%，53／80），两者差异有统计学意义；且与淋巴结转移、浸润深度、胃癌分化程度有关，提示，胃癌组织中Ezrin蛋白的表达可促进胃癌的浸润转移。

1994年国际癌症研究中心将Hp定为人类胃癌第一致癌物［13］。Hp阳性患者胃癌的发生率是Hp阴性患者的2．8－6倍［14，15］。随着人们对 Hp研究的深入，发现Hp在不利于其生长繁殖的环境中易发生细胞壁的缺失而形成Hp－L型。Hp－L型对环境抵抗力强，对抗生素等具有较强的抵抗力［16－17］，是Hp适应外界不良条件的一种自我保护形式。本实验通过对胃癌组织中Hp－L感染的检测，结果显示胃癌组中Hp－L型感染阳性率明显高于对照组，两者有统计学意义（P＜0．05），证实 Hp－L型感染与胃癌的发生密切相关。此外Hp－L型感染还与胃癌的淋巴结转移有关（P＜0．05），表明 Hp－L型感染可能还参与了胃癌的转移过程。本实验显示胃癌组Hp－L型阳性组的Ezrin表达阳性率高于其阴性者，经Spearman等级相关分析发现，胃癌组Ezrin阳性表达与 Hp－L型阳性感染具有正相关性（r＝0．456，P＜0．05），其机制可能为 Hp－L型导致慢性炎症，然后释放肿瘤坏死因子－α在内的各种炎症介质，而肿瘤坏死因子－α又可以激活 Ezrin蛋白［18］，故 Hp－L型感染时可能导致Ezrin的表达上调，二者协同促进肿瘤细胞的远处转移。

综上所述，Ezrin与Hp－L型呈正相关性，并在胃癌的浸润转移中起了重要的作用。

图 版 说 明

图1 胃腺癌中的L型 （革兰染色×1000）

图2 Hp－L型抗原在胃腺癌中的阳性表达（Elivision×400）

图3 Ezrin蛋白在胃癌组织中表达阳性 （Elivision×400）

图4 Ezrin蛋白在正常组织中表达阴性 （Elivision×400）

图5 3例胃癌组织和癌旁正常组织中Ezrin mRNA的表达

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1L－form in gastric adenocarcinoma（Gram stain×1000）

Fig．2Positive expression of Helicobacter pylori L－form in gastric adenocarcinoma Elivision×400

Fig．3Positive expression of Ezrin protein in adenocarcinoma cancerous tissue（Elivision×400）

Fig．4negative expression of Ezrin protein in normal gastric mucosa tissues（Elivision×400）

Fig．5The expression of Ezrin mRNA in 3cases of gastric cancer tissues

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