胰岛素对糖尿病大鼠下颌下腺Bcl－2和Caspase－3表达的影响及意义

崔芳芹 胡明迹 赵云霞 贾雪梅

（1蚌埠医学院病理生理学教研室，安徽233030；2蚌埠市第二人民医院骨科，安徽233000；3安徽医科大学组织与胚胎学教研室，合肥230032）

糖尿病（Diabetes mellitus，DM）是一种多病因的代谢性疾病，其特点是慢性高血糖，伴随着因胰岛素分泌及（或）胰岛素作用缺陷所引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。近年来糖尿病患病率急剧上升，已成为继肿瘤、脑血管疾病之后的威胁人类健康的第三大杀手［1］。众所周知，下颌下腺是三对大唾液腺之一，70%的唾液是由下颌下腺分泌的，属于典型的外分泌腺。2型糖尿病患者有典型的口渴症状，其产生与糖尿病病理导致下颌下腺组织损伤和外分泌功能下降有关［2］。目前研究表明下颌下腺颗粒曲管（Granular convoluted tubule，GCT）上皮细胞可以产生数十种生物活性物质，其中有些因子已完全达到激素的标准，这说明下颌下腺还有很重要的内分泌作用［3］。研究证实糖尿病大鼠下颌下腺组织产生的胰岛素（Insulin，INS）含量降低［4］，表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF）浓度下降［5］，糖原代谢异常改变［6］，而细胞因子［7］、瘦素 （Leptin，Lep）及瘦素受体（Leptin－receptor，Lep－R）［8］随糖尿病病程延长而表达增加。下颌下腺生物学功能减弱，可能与糖尿病时下颌下腺细胞增殖与凋亡失衡有关［9］，但具体发病机制尚不十分清楚。关于凋亡相关因子Bcl－2和Caspase－3表达变化与糖尿病大鼠下颌下腺细胞增殖与凋亡失衡之间的关系，目前尚未见相关报道。本实验用链尿佐菌素（Streptozotocin，STZ）复制2型糖尿病大鼠模型并用胰岛素对其进行治疗，取下颌下腺进行免疫组织化学染色，观察胰岛素对糖尿病大鼠下颌下腺Bcl－2和Caspase－3表达的影响，以期为深入探讨Bcl－2和Caspase－3在糖尿病发病机制中的作用，及为早期使用胰岛素治疗2型糖尿病提供形态学根据。

材料和方法

1．试剂

Bcl－2和Caspase－3的抗体和SP免疫组化试剂盒均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

2．糖尿病动物模型复制

雄性SD大鼠30只，体重（110－160g，普通级），随机分为3组，10只大鼠予普通饲料喂养作为对照组（C组）；20只大鼠一次腹腔注射2%链尿佐菌素，35mg／kg，复制2型糖尿病模型，其中10只予普通饲料喂养作为糖尿病组（DM组）；另外10只大鼠予以胰岛素治疗（3u／d，皮下注射），普通饲料喂养作为胰岛素治疗组（INS组）；连续观察2个月，各组动物均不限制饮食和饮水。

3．标本制备

用20%乌拉坦1ml／100g，腹腔注射，麻醉后剖开腹腔，迅速从腹腔静脉抽5ml血送检血糖、甘油三酯（Triglyceride，TG）和总胆固醇（Total cholesterol，TC）。取出下颌下腺，用10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片（厚度为4μm）。

4．免疫组织化学染色

采用免疫组织化学SP法染色：①石蜡切片常规脱蜡至水，柠檬酸盐缓冲液修复；②3%H2O2，37℃孵育15min；③山羊血清封闭，37℃孵育30min，勿洗；④一抗为兔抗鼠Bcl－2和Caspase－3抗体，稀释浓度均为1∶100，4℃过夜；⑤二抗为生物素标记的山羊抗兔的IgG，37℃孵育15min；⑥辣根酶标记链酶卵白素工作液，37℃孵育30min；⑦以上各步骤之间都PBS液冲洗3次×5min；⑧DAB显色3min，自来水冲洗；⑨苏木精复染2min，自来水冲洗，脱水，透明和封片。用PBS替代第一抗体作为阴性对照。

5．计算机图像分析

在10×40倍光镜下，利用Nikon彩色数码CCD摄像头捕获各组免疫组化染色切片中Bcl－2和Caspase－3的图像，每张切片随机选取5个视野，再用metamorph生物图像软件计算各组Bcl－2和Caspase－3免疫阳性细胞的平均光密度值（MOD）。

6．数据处理

所得数据经SPSS13．0软件进行处理，分析各组Bcl－2和Caspase－3免疫阳性细胞的平均光密度值（MOD），结果均用（¯x±s）表示，组间差异采用q检验，P＜0．05有统计学意义。

结 果

1．血糖结果

DM组血糖分别与C组和INS组血糖比较，均有显著性差异（P＜0．05）；C组血糖与INS组血糖比较，无显著性差异（P＞0．05）（表1）。

2．血脂结果

DM组TG分别与C组和INS组TG比较，均有显著性差异（P＜0．05）；C组TG与INS组TG比较，无显著性差异（P＞0．05）。DM组TC分别与C组和INS组TC比较，均有显著性差异（P＜0．05）；C组TC与INS组TC比较，无显著性差异（P＞0．05）（表1）。

表1 三组大鼠空腹血糖、TG和TC浓度（mmol／L）的比较（±s）Table 1 Comparision of the fasting blood glucose，TG and TC（mmol／L）of the rats in three groups（±s）

表1 三组大鼠空腹血糖、TG和TC浓度（mmol／L）的比较（±s）Table 1 Comparision of the fasting blood glucose，TG and TC（mmol／L）of the rats in three groups（±s）

注：与C组比较：＊P＜0．05；与DM组比较，＃P＜0．05。

组别 n（只） TG TC 血糖C组 10 0．7848±0．2127 1．2506±0．3539 4．1919±1．1668 DM 组 10 1．4951±0．5567＊ 9．6081±5．2476＊ 15．4700±7．1032＊INS组 10 0．8382±0．4921＃ 3．6283±0．7274＃ 5．8513±1．8247＃

3．免疫组织化学染色结果

C组大鼠下颌下腺组织切片中，Bcl－2免疫反应强阳性物主要沉积在颗粒曲管（GCT）导管上皮细胞胞质内，呈棕黄色至棕褐色不等，细胞核及腺泡呈阴性反应（图1A）；与C组比较，DM组Bcl－2表达显著减少，呈弱阳性，浅棕色（图1B）；与DM组比较，INS组Bcl－2表达增强，呈中等强阳性，棕黄色（图1C）。C组大鼠下颌下腺组织切片中，Caspase－3免疫反应弱阳性物主要沉积在颗粒曲管导管上皮细胞胞质内呈浅棕色，细胞核及腺泡呈阴性反应 （图2A）；与C组比较，DM组Caspase－3表达增强呈强阳性，棕褐色（图2B）；与DM 组比较，INS组Caspase－3表达显著减弱呈弱阳性，浅棕色至棕黄色不等（图2C）。

4．计算机图像分析结果

C组大鼠下颌下腺Bcl－2和Caspase－3的MOD值分别与 DM 组Bcl－2和Caspase－3的 MOD值比较，均有差异性（P＜0．05）；DM 组与INS组Bcl－2和Caspase－3的 MOD值比较，均有差异性（P＜0．05）；C 组 Bcl－2 和 Caspase－3 的 MOD 值 分 别 与INS组比较，均无差异性（P＞0．05）（表2）。

表2 三组大鼠Bcl－2和Caspase－3平均光密度值（MOD）的比较（¯x±s）Table 2 Comparision of MOD of Bcl－2and Caspase－3in the submandibular glands of the rats in three groups±s）

表2 三组大鼠Bcl－2和Caspase－3平均光密度值（MOD）的比较（¯x±s）Table 2 Comparision of MOD of Bcl－2and Caspase－3in the submandibular glands of the rats in three groups±s）

注：与C组比较，＊P＜0．05；与DM 组比较，＃P＜0．05

组别 n Bcl－2 Caspase－3 C组10 0．2941±0．0181 0．2399±0．0202 DM 组 10 0．1969±0．0240＊ 0．3107±0．0274＊INS组10 0．2864±0．0219 0．2543±0．0166

讨 论

目前认为Bcl－2基因家族在凋亡中发挥重要作用，Bcl－2可以通过与Bax竞争结合形成异源二聚体，封闭Bax形成孔道的活性，阻止ctyc穿过线粒体膜进入细胞质，从而抵抗细胞凋亡［10］。Caspase－3又称半胱氨酸蛋白酶32（Cysteine protease P32，CPP32），或称为apopain，Caspase－3是参与凋亡Caspase级链反应最终效应子，在蛋白酶级联切割过程中处于核心位置，不同的蛋白酶切割Caspase－3酶原，从而激活Caspase－3，活化的Caspase－3又进一步切割不同的底物，导致蛋白酶级联切割放大，最终使细胞死亡。Caspase－3是多种凋亡途径的共同下游效应部分，也是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，在凋亡的信息传递中居于核心地位［11］，是细胞凋亡发生的关键酶。Caspase－3的活化是细胞凋亡的早期生物化学指标，并与细胞凋亡的形态学表现相互关联［12］。

糖尿病是一种以全身性代谢紊乱为主的内分泌疾病，糖尿病不仅能引发全身代谢紊乱，还可造成眼、肾脏、心血管、脑和神经等多器官和多系统的慢性损害，后者是糖尿病患者致死、致残的主要原因。随着人们对糖尿病及其并发症的发病机制的深入研究，糖尿病病理对下颌下腺生物学功能的影响已经成为医学研究的热点。众所周知，下颌下腺是三对大唾液腺之一，70%的唾液是由下颌下腺分泌的。研究表明糖尿病病理导致下颌下腺的形态结构及外分泌功能异常［2，13］，这可能是引起2型糖尿病口渴的重要原因之一。下颌下腺不仅具有外分泌腺的功能，它还是产生生物活性物质种类最多的器官之一。目前研究发现，下颌下腺所产生的有显著生物活性物质可达50多种，其中有些因子已完全达到激素的标准，这些生物活性物质主要定位于GCT上皮细胞内，它们直接分泌入血，或随唾液进入消化道再由胃肠吸收入血，在多种组织和细胞的生理活动中起重要调节作用，因此，下颌下腺又具有内分泌功能［3］。有研究发现EGF是下颌下腺产生的主要生物活性物质之一，它广泛作用于机体各组织和器官［14］。有报道显示，在仓鼠下颌下腺GCT细胞胞质中产生若干种细胞因子［15］，这意味着下颌下腺可能参与机体的免疫防御和免疫调节。贾雪梅等发现小鼠下颌下腺GCT细胞内生长抑素呈免疫反应阳性［16］，生长抑素的存在，对神经节细胞内共存的其他神经肽的释放以及腺泡的分泌活动可能具有一定的影响。下颌下腺还能分泌多种促细胞生长与分化因子［17］。有人将下颌下腺视为消化道弥散性神经内分泌系统的一部分，是具有内分泌和外分泌双重功能的腺体，因此对下颌下腺形态及功能研究具有重要临床意义［18］。Patel研究STZ糖尿病小鼠模型时，发现下颌下腺内胰岛素含量与胰腺内胰岛素同时降低［4］，下颌下腺及血浆中的表皮生长因子浓度均下降，从而推测糖尿病导致EGF缺乏，继而引起一系列其它的继发性病理变化［5］。本课题组前期研究观察到糖尿病大鼠下颌下腺的腺泡萎缩，细胞排列紊乱，GCT导管上皮细胞萎缩，局部结缔组织明显增多等病理变化［19］。但糖尿病大鼠下颌下腺GCT导管上皮细胞发生萎缩的病理机制尚不十分清楚，可能与细胞增值与凋亡失衡有关［9］。本实验发现DM组大鼠下颌下腺GCT导管上皮细胞Bcl－2表达较C组显著减少（P＜0．05），而Caspase－3表达较C组显著增强（P＜0．05），从而提示糖尿病时下颌下腺GCT导管上皮细胞凋亡活动增强。Bcl－2和Caspase－3表达异常变化可能是导致GCT导管上皮细胞发生萎缩等退行性病变的重要机制之一，可能引起糖尿病下颌下腺生物学功能发生异常变化，并可能在糖尿病及其并发症的发生发展过程中发挥重要作用。

胰岛素是体内唯一降低血糖的激素，且不会导致依赖性和成瘾性；但长期以来，胰岛素没有得到及时、合理的应用［20］。2型糖尿病是一种缓慢进展性疾病，其发病的中心环节是胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能缺陷。胰岛素缺乏可造成脂肪代谢紊乱，使脂肪合成减少，分解代谢增加，导致血脂升高，进而可引起动脉硬化［21］等严重糖尿病并发症。本实验研究证实胰岛素不仅能显著减低糖尿病大鼠血糖、TG和TC浓度，还具有显著促进下颌下腺GCT细胞Bcl－2表达上调和Caspase－3下调的作用；因此早期应用胰岛素治疗2型糖尿病，不仅能控制糖脂代谢紊乱，还能对抗糖尿病下颌下腺细胞凋亡，保护GCT上皮细胞的生物学功能，也可能在减轻糖尿病慢性并发症的发生和发展中发挥积极的保护作用。胰岛素能上调Bcl－2和下调Caspase－3的表达，可能与胰岛素具有降血糖、血脂的作用，从而减轻高血糖、高血脂对DM大鼠下颌下腺结构损害；胰岛素能增加全身组织细胞对葡萄糖的摄取和利用，可促进脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）及三磷酸腺苷（ATP）的合成；胰岛素可促进钾离子和镁离子穿过细胞膜进入细胞内，对组织细胞具有保护作用。然而，胰岛素使糖尿病大鼠下颌下腺GCT导管上皮细胞内Bcl－2表达下调和Caspase－3表达上调的具体机制尚不十分清楚，仍需下一步深入探讨。

综上所述，糖尿病大鼠下颌下腺GCT上皮细胞内Bcl－2表达上调 和Caspase－3表达下调，导致糖尿病下颌下腺GCT细胞凋亡增强，这可能为Bcl－2和Caspase－3在糖尿病发病机制中的作用及意义提供形态学根据。胰岛素具有抗糖尿病下颌下腺细胞凋亡的作用，也为临床上早期应用胰岛素治疗2型糖尿病提供了实验室依据。

图 版 说 明

图1A C组大鼠下颌下腺GCT（↑）上皮细胞胞浆内Bcl－2免疫反应呈强阳性，SP×400

图1B DM组大鼠下颌下腺GCT（↑）上皮细胞胞浆内Bcl－2免疫反应呈弱阳性，SP×400

图1C INS组大鼠下颌下腺GCT（↑）上皮细胞的胞浆内Bcl－2免疫反应呈中等强阳性，SP×400

图2A C组大鼠下颌下腺GCT（↑）上皮细胞胞浆内Caspase－3免疫反应呈弱阳性，SP×400

图2B DM组大鼠下颌下腺GCT（↑）上皮细胞胞浆内Caspase－3免疫反应呈强阳性，SP×400

图2C INS组大鼠下颌下腺GCT（↑）上皮细胞胞浆内Caspase－3免疫反应呈弱阳性，SP×400

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1AStrong positive immuoreactivity of Bcl－2in epithelial cells of group Control，GCT （↑），SP×400

Fig．1BLower positive immuoreactivity of Bcl－2in epithelial cells of group DM，GCT （↑），SP×400

Fig．1CMiddle positive immuoreactivity of Bcl－2in epithelial cells of group INS，GCT （↑），SP×400

Fig．2ALower positive immuoreactivity of Caspase－3in epithelial cells of group Control，GCT （↑），SP×400

Fig．2BStrong positive immuoreactivity of Caspase－3in epithelial cells of group DM，GCT （↑），SP×400

Fig．2CLower positive immuoreactivity of Caspase－3in epithelial cells of INS group，GCT （↑），SP×400

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