UL27、UL29 基因shRNA 表达载体的构建及对HSV-2 的干扰效应研究

吕延成 潘晓瑜 黄畅 丁娟

（遵义医学院珠海校区 生化与分子细胞生物学教研室，珠海 519040）

Ⅱ型单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus type 2，HSV-2）是生殖器疱疹（GH）的主要病原体。HSV-2 一旦感染将终身潜伏在骶神经节［1，2］。近年来的研究认为，Ⅱ型单纯疱疹病毒感染和艾滋病［3］、宫颈癌的发病密切相关性［4-7］，国内外研究显示HSV-2 患病率呈不断上升趋势［8］。目前治疗生殖器疱疹主要使用广谱抗病毒药物，治疗的目的主要是缓解症状，缩短病程，减轻疼痛及防止继发感染等［9，10］。同时随着各种激素的大量使用，HSV-2病毒耐药性有逐渐增加的趋势［11，12］。因此，寻找新的抗病毒治疗策略，研制新型抗病毒药物已成为当今HSV-2 感染后治疗的研究热点。

RNA 干扰（RNA interference，RNAi）能够使mRNA 发生降解而导致基因表达沉默，是一种新型的基因阻断技术，能高效、特异的抑制基因表达。运用RNAi 干扰技术抑制病毒增殖和感染是当前抗病毒研究领域的热点之一［13-16］，目前国内外运用RNAi 技术，特别是联合干扰对HSV-2 的研究报道较少。

HSV-2 是生殖器疱疹的主要病原体，UL27、UL29 都在病毒感染过程中起重要作用，因此以UL27 基因、UL29 基因为靶点的治疗具有广阔前景。HSV-2 UL27 基因编码的gB 蛋白是在感染细胞中含量最多的糖蛋白，gB 的胞浆区是12 个包膜糖蛋白中最长的，提示它在感染过程中起重要作用。gB 以寡聚体形式存在于病毒包膜上，并与细胞膜上氨基聚糖硫酸乙酰肝素或硫酸软骨素结合，使病毒吸附于宿主细胞膜上，介导病毒包膜与细胞膜融合、病毒穿入和胞间扩散，引发病毒循环复制过程。gB 是宿主细胞免疫和体液免疫的主要靶标，也是HSV-2特异性细胞毒性T 淋巴细胞的主要靶标。gB 表达缺失必定影响病毒吸附和穿入细胞，从而抑制HSV-2的感染。UL29 基因编码合成的ICP8 蛋白单链DNA结合蛋白，调控病毒DNA 复制和γ 基因的表达。研究表明，该蛋白是病毒复制所必须的，一旦发生突变则可影响晚期基因的表达和DNA 的合成。该蛋白主要作用是结合病毒RNA 从细胞核运输到细胞质，抑制pre-mRNA 的剪切等。

本研究利用RNA 干扰技术，针对HSV-2 UL27、UL29 基因分别设计、合成8 对寡核苷酸，采用基因重组技术构建shRNA 表达载体，通过脂质体转染法将shRNA 表达载体转入细胞后表达siRNA，再接种HSV-2。通过实时荧光定量PCR 法检测UL27、UL29 mRNA 的转录水平，分析shRNA 表达载体对UL27 和UL29 基因的抑制效果。筛选出干扰效率高的表达载体，进行联合干扰试验，用终点滴定法检测干扰后的子代病毒滴度；用MTT 法检测细胞的存活率；用蛋白免疫印迹技术检测目的基因蛋白表达水平。旨在为进一步研究通过RNAi 手段抑制HSV-2 的关键基因的表达治疗HSV-2 提供试验依据和理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

HEK293 细 胞、大 肠 杆 菌DH5α 由 遵 义 医 学院珠海校区中心实验室提供；HSV-2 333 标准株来源于美国标准生物品收藏中心（ATCC）；质粒pGPU6/GFP/Neo 全长5 117 bp，购自上海吉玛制药技术有限公司。限制性内切酶BamH I、Bbs I、Pst I 购自美国Fermentas，T4 DNA 连接酶购自杭州碧云天生物技术研究所，RNA 提取试剂RNAisoTMPlus、SYBR® PrimeScript® RT-PCR Kit 购自宝生物工程（中国大连）有限公司，DMEM 培养基购自美国GIBCO，新生牛血清购自杭州四季青公司，转染试剂Lipofectamine2000 购自Invitrogen 公司，鼠抗gB、ICP8 单抗购自美国Santa cruz 公司。

1.2 方法

1.2.1 shRNA 表达载体的构建 从GenBank 上获得HSV-2（NC_001798）UL27 和UL29 基因序列，利用Invitrongen 公司的shRNA 在线设计软件，进行靶序列的初筛。用Blast 检索将初筛的靶序列与其他人类基因组进行比对，通过RNA structure 5.0 软件对靶mRNA 的二级结构进行模拟分析，筛选出4 条特异性序列作为靶序列，同时在试验中设计不针对任何基因的序列为阴性对照（Negative control，NC），见表1。

表1 筛选的HSV-2UL27、UL29 靶序列

表1 中 DNA 序列由上海吉玛制药技术有限公司化学合成，将寡核苷酸链退火形成shRNA 模板双链，通过T4 连接酶连接到pGPU6/GFP/Neo 上，形成pGPU6/GFP/Neo-shRNA 表达重组载体，转化后挑取单菌落，扩大培养后提取质粒，用Pst I、BamH I进行酶切鉴定。

1.2.2 pGPU6/GFP/Neo-shRNA 表达载体转染HEK-293 细胞 HEK293 细胞在10% FBS 的DMEM 培养液中，37℃，5% CO2条件下培养。取对数生长期的HEK293 细胞以4×104-5×104个/孔接种于24 孔板，待细胞丰度到80%时，用100 μL 质粒/lipofectamin2000 复合物加到含有细胞24 孔培养板的孔中，继续培养48 h 后；试验分为4 组：空白组（空载体）、阴性对照组（shRNA NC）、对照组（shRNAGAPDH）、各干扰组，每组设3 个复孔，分别于12、24、36 和48 h 在倒置荧光显微镜下观察GFP 表达情况，收集细胞，用流式细胞仪检测，计算含有荧光的细胞占总细胞数的百分比。

转染效率（%）=荧光细胞数量/细胞总数×100%

1.2.3 HSV-2 感染HEK293 细胞 HSV-2 接种HEK-293 细胞，用2%病毒维持液培养病毒，反复冻融法收获子代病毒。采用终点滴定法测定病毒滴度。按Reed-Muench 法计算，能引起50%细胞发生病变的病毒最高稀释度（50% tissue culture infective dose，TCID50），即病毒滴度。各试验组在37℃，5% CO2饱和湿度培养箱中培养48 h 后，再接种TCID50病毒。1.2.4 实时荧光定量PCR 检测UL27 基因的转录水平 病毒感染48 h 后，抽提细胞总RNA，进行反转录。采用实时定量PCR 仪进行PCR 扩增，用SYBRGreen I 检测。以GAPDH 作为内参检测各组细胞内mRNA 表达水平，引物由上海生物工程公司合成。引物序列如下：内参GAPDH 上游引物：5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，下游引物：5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'；UL27 上游引物：5'-CAAAGACGTGACCGTGTCGCAG-3'，下游引物：5'-GCGGTGGTCTCCATGTTGTTCC-3'。反应条件：95℃ 5 min；95℃ 20 s，62℃ 30 s，70℃ 30 s，共40 个循环。反应结束后，以每孔GAPDH 的定量作为标准，分别校正各孔UL27 基因表达的差异，各组表达量采用2-△△Ct计算。

1.2.5 Western blot 检测蛋白表达 细胞接种HSV-2 48 h 后，收集细胞，提取蛋白。采用BCA 法测定蛋白质浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶电泳分离，通过电转移法将蛋白质从SDS-PAGE凝胶转移至PVDF 膜。后者在含5%脱脂奶粉的PBST 中37℃封闭90 min，加入一抗4℃孵育过夜；PBST 充分漂洗（10 min×3 次），加入二抗37℃作用40 min；PBST 充分漂洗（10 min×3 次）；化学荧光法（ECL）显色，以GADPH 蛋白为内参照，曝光获取图像，比较各组蛋白表达量。

1.2.6 子代病毒滴定及MTT 法测定293 细胞存活率 细胞转染siRNA 并感染病毒后，使用终点滴定法，对上述收集的子代病毒液进行病毒滴度测定，采用MTT 法，对细胞的存活率进行测定。

1.2.7 统计学处理 用SPSS13.0 软件进行统计分析，所有数据采用均数标准差（x-±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两组间比较采用LSD 检验。P<0.05 表示显著性差异。

2 结果

2.1 表达载体pGPU6/GFP/Neo-shRNA酶切鉴定结果

shRNA 模板成功插入到质粒pGPU6/GFP/Neo 上时，原质粒上的Pst I 酶切位点被置换消失。如果构建成功，则pGPU6/GFP/Neo-shRNA 可以被BamH I切开，而不能被Pst I 切开。Pst I 酶切结果显示有两条带，分别为超螺旋的SC 构型和质粒的松弛开环OC 构型，这两条带可以证明重组质粒不能被Pst I 酶切。重组体被BamH I 单酶切而线性化，条带在5 100 bp 左右（图1）。

图1 重组质粒的Pst Ⅰ和BamH Ⅰ酶切电泳图谱

2.2 细胞转染效率测定

pGPU6/GFP/Neo-shRNA 表达载体转染HEK293细胞转染48 h 后，GFP 的表达达到高峰。流式细胞仪测得转染后12、24 和48 h 含有荧光的细胞占细胞数的百分比分别为22.5%、37.5%和80%（图2，图3）。可见转染48 h 后，转染效率最好。

图2 pGPU6/GFP/Neo-shRNA 重组载体转染细胞48 h 图像（100×）

2.3 HSV-2病毒滴度测定

通过终点滴定法测定HSV-2 病毒TCID50，以确定感染细胞所需的病毒量。计算结果显示，TCID50为10-3.5/100 μL。表2 显示，能使50%细胞出现病变的稀释度在10-3与10-4之间。

图3 流式细胞仪测定转染效率

表2 HSV-2 病毒滴度滴定结果

2.4 HEK293细胞形态学改变

各组shRNA 转染细胞并感染HSV-2 48 h 后，以正常细胞空白组、阴性对照组（shRNA NC）为参照，观察细胞病变情况。结果（图4）显示，接种24 h 后，可见阴性组多数细胞融合为多核巨细胞。接种48 h后，大部分细胞脱落，多核巨细胞裂解为细胞碎片。以正常细胞为对照，干扰组细胞均出现不同程度的细胞病变效应（Cytopathic effect，CPE）。

图4 各组HEK293 细胞的CPE（100×）

2.5 shRNA表达载体对UL27、UL29mRNA各组的抑制效果

接种HSV-2 48 h 后，用荧光定量PCR 法检测各组细胞内HSV-2 mRNA 的表达量。图5 显示在单干扰组中UL27 shRNA75 对UL27mRNA 的抑制率最高，为75.17%，UL29 shRNA1461 对UL29mRNA 的抑制率最高，为66.08%。

2.6 UL27、UL29联合干扰表达载体对mRNA的抑制效果

联合干扰组接种HSV-2 48 h 后，实时荧光定量PCR 法检测各组细胞mRNA。结果（表3）显示，UL27 shRNA75+UL29 shRNA1461 联合组对UL27 基因表达的CT 值为30.16±0.11，对UL29 基因表达的CT 值为28.72±0.24，联合干扰组与空白对照组比较具有显著性差异（P<0.05）；而阴性对照组与空白对照组相比，无显著性差异（P>0.05）。

图5 shRNA 表达载体对UL27、UL29mRNA 的抑制效率

表3 shRNA 联合表达载体对mRNA 的抑制效果

2.7 终点滴定法测定子代病毒滴度

HEK293 各组细胞接种HSV-2 48 h 后，收集子代病毒液进行病毒滴度测定，病毒滴度用TCID50计算。与空白对照组、阴性对照组比较，干扰组（UL29 shRNA939 和UL29 shRNA1653）病毒滴度有下降，但未有显著性差异（P>0.05）；其余各干扰组病毒滴度均有不同程度下降，有极显著性差异（P<0.01）。

表4 转染后各组的病毒滴度测定

2.8 shRNA质粒表达载体对HSV-2蛋白表达效果的影响

各转染组接种病毒48 h 后，分别收集细胞提取蛋白，然后经电泳，转印后，加入gB 抗体和ICP8 抗体对目的蛋白进行检测，其中UL27 shRNA75+UL29 shRNA1461 联合干扰组与单干扰组相比，蛋白表达量明显减少（P<0.05）（图6）。

2.9 MTT法检测293细胞存活率

各转染组接种病毒48 h 后，弃上清加入10 μL MTT 溶液（5 mg/mL）继续孵育4 h，然后每孔加入100 μL DMSO，振荡10 min，酶标仪下读取吸光度，计算细胞存活率。结果（图7）显示，联合干扰组UL27 shRNA75+ UL29 shRNA1461 的细胞存活率最高。

3 讨论

近年来，对RNAi 的研究现状分析，在哺乳类动物中，RNAi 并不能完全阻断基因的表达，对阻断基因的mRNA 水平表达量有一定的限度［17］，siRNA 在 细 胞 内 与RISCs（RNA-induced silencing complexes）结合后，通过其识别并沉默相应的mRNA，RISCs 有一定的饱和度，过多的siRNA 反而可能抑制其活性，也不可能无限增大siRNA 的浓度。因此将两种基因或者多个基因的分子靶向治疗相结合正成为日益活跃的研究领域。其原因有：其一，由于病毒感染是一个多因素、多阶段、多基因参与的复杂过程，病毒对不同的基因治疗的敏感性有差异，单一的基因治疗往往不能取得良好的疗效，随着病毒的突变，可能在一定程度上抵消其作用，联合基因治疗有望提高疗效。其二，采取不同的治疗途径，利用各个基因治疗的优点，提高治疗效果，降低对机体正常组织的副作用。

因此本试验针对HSV-2 UL27 和UL29 基因各筛选出的4 条靶序列构建特异性shRNA 质粒表达载体，在体外细胞水平上观察研究RNAi 对HSV-2 的抑制效应以及二者联合干扰对HSV-2 的抑制效应。试验中UL27、UL29 各筛选出的4 条靶序列的沉默效果各有差异，其中在mRNA 水平上的单干扰组中UL27 shRNA75 组对UL27 基因mRNA 的抑制率为75.17%，UL29 shRNA1461 组对UL29 基因mRNA 抑制率为66.08%，UL27 shRNA75+UL29 shRNA1461联合干扰组对UL27 基因抑制率约为91.28%，UL29基因表达抑制率约为80.40%，并用Western blotting 技术在蛋白水平上得到验证。在此基础上，进一步从子代的病毒滴度的变化、细胞的形态学变化和细胞的存活率等方面检测pGPU6/GFP/Neo-UL27、pGPU6/GFP/Neo-UL29 重组表达载体对HSV-2 复制的影响。经空白对照组和阴性对照组及各单干扰组的比较说明，UL27 shRNA75+UL29 shRNA1461 联合干扰组的子代病毒滴度最低，细胞的存活率也更高，说明其能更好地抑制HSV-2 的复制。

由此可见，HSV-2 UL27 基因在病毒感染阶段起关键作用，而UL29 基因都在病毒复制过程中起重要作用，因此联合干扰二者的合成，对阻止HSV-2病毒吸附和穿入以及干扰病毒DNA 合成复制，从而抑制HSV-2 病毒的感染与复制。本试验结果表明联合靶向干扰效果优于各自的单个干扰，显示两个基因之间具有相互协同效应，能够相互联合增强对单一基因的抑制。HSV-2 复制循环包括吸附、穿入、脱衣壳、DNA 复制、转录、翻译、蛋白质合成、核衣壳组装和病毒释放等顺序过程。可能缺失了gB 的病毒就丧失了感染的能力，导致之后整体的HSV-2的DNA 复制就下降了。基于基因之间的相互联系和作用，导致相应的单链DNA 结合蛋白也会减少，从而进一步抑制HSV-2 DNA 的复制。提示联合靶向特异性shRNA可能从不同途径阻止HSV-2感染和复制，还可能减少shRNA 抗病毒感染过程中出现病毒变异株的概率。

图6 Westernblot 检测gB 和ICP8 蛋白的表达结果

图7 MTT 法测定293 细胞存活率

HSV-2 在宿主细胞内的复制增殖由多种病毒蛋白和宿主蛋白之间的协同作用所决定，因此可以进一步研究针对不同的病毒关键基因，如ICP4、UL54、US3 等进行多个靶点shRNA 的设计，亦可将UL27 和UL29 的特异性siRNA 构建于同一个shRNA重组表达载体，或者同一基因的两个特异性siRNA构建于同一个表达载体，转染进入细胞，这些方法可能会产生更高效的抑制作用。

4 结论

本研究成功构建并筛选了有效抑制病毒复制的pGPU6/GFP/Neo-UL27、pGPU6/GFP/Neo-UL29 重 组表达载体，转染HEK293 细胞，可以降低子代的病毒滴度、抑制UL27、UL29 基因的mRNA 和蛋白的表达，提高细胞的存活率。

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