杀真菌素链霉菌AL-04 的筛选与鉴定

李增波 孙红艳 赵静娴 周剑武 梁栋 高晔

（太原科技大学化学与生物工程学院，太原 030021）

近年来，随着设施园艺的迅速发展，各种植物病害相继出现，其中土传真菌病害尤为严重，已成为制约设施农业发展的重要因素［1］。目前，土传病害主要采用化学农药进行防治，但防效不佳，且存在易污染环境、病原菌耐药性及成本较高等问题，无法适应现代农业发展的需要。放线菌是农用抗生素的主要产生菌，其在防治土传病害、改善植物营养和土壤理化性状等方面具有显著作用，正越来越受到人们的关注和重视［2］。本研究依赖本实验室建立的放线菌库，主要针对目前生产上发病面积较广，对园艺作物生产影响较大的土传真菌病害，采用琼脂扩散法、生长速率法、孢子萌发抑制法及离体组织法，筛选高效且活性稳定的拮抗菌株，旨在探索新的土传病害生防途径，并为商品化生防菌剂的开发和应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试放线菌 通过平皿体外试验，从青藏高原土壤中分离纯化到的4 500 余株放线菌［3，4］中筛选得到13 株放线菌。

1.1.2 活性检测靶标菌 辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici，代号为P3）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum，代号为H）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum，代号为X）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea，代号为F）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureaus，代号为A）、埃希氏大肠杆菌（Escherichia coli，代号为E）、青霉（Penicillium，代号为P）、白色假丝酵母（Candida albicans，代号为Y）、黑曲霉（Aspergillus niger）、木霉（Trichoderma sp.），均由本实验室保存。

1.1.3 培养基 肉胨培养基［5］、高氏1 号培养基［5］、PDA 培养基［5］、改良PDA 培养基［3］、黄豆粉培养基［3］、发酵培养基（黄豆粉 20 g，蔗糖 3 g，蛋白胨 2 g，淀粉 10 g，酵母膏 2 g，NaCl 2 g，K2HPO41 g，ZnSO40.01 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO32 g，水 1 000 mL，pH7.2），所有试剂均为市售分析纯。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌株的筛选

1.2.1.1 琼脂扩散法［6］将13 株放线菌分别制成菌悬液，取100 μL 菌悬液涂布接种在黄豆粉培养基上，培养7 d 后，用打孔器打取7 mm 菌饼放入指示菌平板上，设3 个平行。于28℃培养3 d 后，十字交叉法测量抑菌圈直径。

1.2.1.2 生长速率法［6］将13 株放线菌分别制成孢子悬浮液，孢子悬浮液按10%（V/V）的接种量接种于装有50 mL 发酵培养基的300 mL 摇瓶中，28℃，180 r/min 振荡培养5 d 后，于5 000 r/min 离心，用0.22 μm 滤膜过滤除菌得到无细胞滤液。取5 mL 无细胞滤液，按滤液∶培养基=1∶5 的比例与25 mL的PDA 培养基（灭菌后冷却至50℃左右）混合，待凝固后，将预先培养5 d 的7 mm 病原菌菌饼（西瓜枯萎、黄瓜枯萎、番茄灰霉、辣椒疫霉）放置于混配平板上，每个处理3 个平行，28℃培养72 h 后将培养皿取出，用游标卡尺测量菌落直径（十字交叉测量两次，取平均值），以3 次平行菌落直径的平均值计算抑菌率。

1.2.1.3 真菌孢子萌发情况测定［7］取上述无细胞滤液1 mL，加入10 mL 无菌水，分别接入4 种真菌（黑曲霉、青霉、木霉和辣椒疫霉）孢子悬浮液100 μL，孢子浓度为镜检时40 倍视野下孢子数30-50 个。28℃培养6 h 后，取50 μL 于载玻片上，在40 倍镜下观察孢子萌发情况（萌发率和抑制率）。

1.2.1.4 离体叶片法［8］同1.2.1.2 方法得到13 株放线菌的无细胞滤液。取无细胞滤液20 mL 加入无菌培养皿，同时再取一个无菌培养皿加入20 mL 灭菌清水作为空白对照。剪取生长整齐一致的植物叶片（辣椒、黄瓜、番茄）用清水洗净，分别放入装有以上两种溶液的平皿中浸泡30 min，取出叶片沥干滤液，取无菌培养皿，放入一张与平皿大小一致的无菌滤纸，并加入无菌水4 mL，将已晾干的叶片放在吸水滤纸上，把一个活化好的直径7 mm 的病原菌菌饼放于叶片上，盖上平皿置28℃保温保湿培养，检查叶片染病情况及防治效果。每个处理50 个重复。

1.2.2 拮抗菌株的鉴定

1.2.2.1 形态特征 采用高氏1 号平板培养基进行埋片培养（30℃，7 d）。取埋片用2.5%戊二醛固定12 h 后，用0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.2）漂洗3次，转入1%锇酸溶液中固定1 h，再用上述缓冲液漂洗3 次，分别经50%-100%乙醇梯度脱水，置醋酸异戊酯中20 min，取出，临界点干燥，喷金后于扫描电子显微镜下观察菌体形态特征［9］。

1.2.2.2 培养特征和生理生化特征 参照《链霉菌鉴定手册》推荐的标准培养基和常用生理生化方法培养、观察和记录［10］。

1.2.2.3 细胞化学分析 采用Hasegawa 等［11］和王平［12］改进的快速薄层层析法进行全细胞氨基酸及全细胞水解液糖型的分析。

1.2.2.4 抗药性测定 把各种抗生素按一定浓度配制好，待灭完菌的高氏培养基的温度降低到50℃左右时，再把抗生素加到培养基中充分混匀，倒平板备用。将预先培养好的菌体用接种针轻轻点接在平板上。以不加抗生素的高氏平板作为阴性对照，30℃下培养7-14 d 后记录结果。培养基中抗生素利福平、诺弗沙星、链霉素、红霉素、氯霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素的浓度为0.25 mg/mL，环丙沙星、青霉素浓度为5.0 mg/mL。

1.2.2.5 基于16S rDNA 基因序列的系统发育分析 参照文献［13］的方法提取基因组DNA，然后PCR 扩增16S rDNA 基因。其中PCR 扩增引物采用通用引物，即正向Pf：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'；反向Pr：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACT-3'。PCR 扩增条件为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸2 min，35 个循环；72℃延伸10 min。PCR 产物纯化与序列测定由上海生物工程公司完成。16S rDNA 基因测序后，利用Blast 搜索引擎从GenBank 数据库中调出相关放线菌菌株的16S rDNA 基因序列，用Clustal X 软件进行多序列比对并计算供试菌株与参比菌株之间的序列相似性，用Mega 3.1 软件构建系统进化树。

1.2.3 数据分析 采用Excel 2003 及SAS 8.2 进行相关处理的数据统计和方差分析。

2 结果

2.1 拮抗菌株的筛选

2.1.1 离体拮抗性试验结果 为了获得广谱活性菌株，通过琼脂平板拮抗性试验，对13 株供试放线菌进行初筛。结果（表1）显示，供试13 株放线菌均对4 种以上的病原菌有拮抗作用，抑菌圈直径均在14.0 mm 以上。其中对5 种病原菌有抑制作用的菌株有AL-06、AL-07 和AL-10；对7 种病原菌有抑制作用的菌株有AL-03、AL-04，其中AL-04 的抑菌圈直径平均为20.0 mm 以上，表现出较强的生物活性。

表1 13 株放线菌的抑菌圈直径（mm）

2.1.2 供试菌株对病原菌菌丝生长的抑制作用 为了筛选到抗病原真菌的高效菌株，采用生长速率法对上述菌株进行验证，结果（表2）显示，对西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）抑制率达50%以上的菌株为AL-04、AL-06 和AL-10，其中AL-10 菌株的抑制率为93.9%；对黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum）抑制率达50%以上的菌株为AL-04、AL-05、AL-08 和AL-10，其中AL-04 的抑制率为85.7%；对番茄灰霉病菌（Botrytis cinere）抑制率达50%以上的菌株为AL-04、AL-10，其中AL-10 的抑制率为77.8%；对辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）抑制率达50%以上的菌株为AL-02、AL-03、AL-04、AL-05、AL-06、AL-10、AL-11 和AL-13，其中AL-02 的抑制率为95.3%。由此可知，供试13 株拮抗菌中，对4 种病原病菌抑制效果（抑制率>70%）的高效菌株为AL-04 和AL-10。

表2 13 株放线菌对4 种靶标菌的抑菌率（%）

2.1.3 供试菌株对指示菌孢子萌发的抑制作用 依据稻瘟筛选模型，以黑曲霉（Aspergillus niger）、木霉（Trichoderma sp.）、青霉（Penicillium）和辣椒疫霉（Phytophthora capsici）作为指示菌，通过测定供试菌株发酵滤液对其孢子萌发率的影响，筛选抗植物病原真菌的高效拮抗菌株。结果（表3）显示，13 株放线菌的发酵滤液对4 种指示菌孢子的萌发均有不同程度的抑制作用。抑制率均达到70.0%以上的菌株有AL-03、AL-04、AL-06、AL-07 和AL-10。同生长速率法结果一致，AL-04 和AL-10 两株菌仍显示出高效的拮抗活性。

表3 13 株放线菌对4 种靶标菌孢子萌发的抑制率（%）

2.1.4 离体叶片试验结果 在生防菌的筛选过程中，经常会遇到室内试验与田间试验结果差距较大等问题，因而有必要建立离体植物组织筛选模式，以检测生防菌的活性和生防效果。离体组织测定法是介于体外抗菌活性测定法和植物测定法之间的一种测定方法，它既可保证一定数量的菌株筛选，也能使测定条件比较接近大田条件。离体叶片法是离体组织测定法中最常用的一种方法，离体叶片法与植株法比较具有占用空间小、试验条件容易控制、方便、快速等优点，是室内抗性鉴定的好方法。

辣椒、黄瓜、番茄均为常见园艺作物，其易受病害危害且材料容易获取，因此取其进行离体叶片测定试验。结果（表4）显示，供试13 株放线菌对辣椒疫霉病菌、黄瓜枯萎病菌、番茄灰霉病菌的抑制作用有所不同：AL-02、AL-04、AL-10 和AL-11发酵液对辣椒疫霉的防治效果均在70.0%以上，其中AL-04 的 防 治 效 果 达90.0%；AL-04、AL-08 和AL-10 发酵液对番茄灰霉病菌均有抑制作用，防治效果在60%以上，其中AL-04 和AL-10 的防治效果为70.0%；AL-04、AL-05 和AL-10 发酵液对黄瓜枯萎病菌有抑制作用，其中，AL-05 和AL-10 的防治效果为70.0%，AL-04 的防治效果为80.0%。

从上述4 种方法的活性检测试验中发现，AL-04菌株始终表现出很强的生物活性，因此选定AL-04菌株进行下一步的研究。

表4 13 株放线菌对供试植物叶片的防治效果（%）

2.2 AL-04菌株的鉴定

2.2.1 形态特征 AL-04 放线菌在高氏1 号培养7 d，菌落呈白色至淡灰色、致密表面、边缘光滑平坦（图1-A）。光镜和扫描电镜观察发现，该菌株基丝发育良好，呈现浅黄色，多分枝，无横隔，不断裂，气丝生长旺盛，呈现淡紫灰色，宽0.4-0.5 μm，在气丝上生有长孢子链，为松弛疏螺旋，孢子链长，分化为孢子，孢子球形至卵圆型，表面光滑无刺，直径0.5 μm 左右（图1-B 和1-C）。

2.2.2 培养特征 AL-04 菌株在葡萄糖-天冬酰胺琼脂上基内菌丝为乳白色，气生菌丝发达为浅橄榄石灰；在甘油-苹果酸钙琼脂上，基内菌丝为杏仁黄，气生菌丝为茧白色；在淀粉-酪蛋白琼脂上，基内菌丝为荔肉白色，气生菌丝为灰白色；在察贝克氏琼脂上，基内菌丝为豆汁黄色，气生菌丝为鸽子灰色；在麦芽汁-酵母膏琼脂（ISP2）上，基内菌丝为乳白色，气生菌丝为艾绿色；在燕麦片琼脂（ISP3）上，基内菌丝为莲子白色，气生菌丝为银灰色；在酵母膏-淀粉琼脂上，基内菌丝为蚌肉白色，气生菌丝为灰白色；在无机盐-淀粉琼脂（ISP4）上，基内菌丝为淡茧黄色，气生菌丝为淡紫灰色；在甘油-天冬酰胺琼脂（ISP5）上，基内菌丝为乳白色，气生菌丝为淡绿色；在马铃薯块上，基内菌丝为橄榄石灰色，气生菌丝为淡紫灰色。该菌在各培养基上均无可溶性色素产生。

2.2.3 唯一碳、氮源利用和生理生化特征 AL-04菌株能利用D-葡萄糖、D-木糖、D-果糖、鼠李糖、蔗糖、DL-肌醇、D-甘露醇、半乳糖、乳糖、麦芽糖、甘露糖、甘油、山梨醇、丙酮酸、丁二酸钠等碳源，不利用L-阿拉伯糖、棉子糖、醋酸钠、柠檬酸钠、草酸钠、马尿酸钠、酒石酸钠；可以利用酪氨酸、丝氨酸、DL-天冬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、腺嘌呤、尿素、KNO3、NaNO3、（NH4）2SO4等氮源。该菌能使明胶液化和分解纤维素，并使石蕊变蓝和淀粉水解，硝酸盐还原和卵磷脂酶反应阳性，不胨化和凝固牛奶，不产生H2S 和黑色素。最适生长温度为24-32℃，低于14℃和高于38℃则停止生长。

2.2.4 细胞壁氨基酸分析 AL-04 菌株细胞壁中含有L-DAP（L 型二氨基庚二酸）和甘氨酸，属于Ⅰ型细胞壁，符合链霉菌属（Streptomyces）的化学分类特性。

2.2.5 耐药性分析 AL-04 菌株能在利福平、环丙沙星、诺氟沙星、红霉素、氯霉素、青霉素、氨苄青霉素的平板上生长，不能在链霉素庆、大霉素、卡那霉素的平板上生长。

图2 基于16S rDNA 的系统发育树

2.2.6 分子鉴定结果 菌株AL-04 的16S rDNA 核酸序列长度为1 448 bp，GenBank 登录号为JN368424。通过与NCBI 中模式菌株的16S rDNA 序列比对分析和系统发育树的构建（图2），发现菌株AL-04 与杀真菌素链霉菌（Streptomyces fungicidicus）的4 个菌株在进化树上位于同一个分支，其中与Streptomyces fungicidicus MML1614（EU344795）同源性达到99.6%。因此，参照链霉菌的分类鉴定手册，结合菌株AL-04 的形态特征、培养特征、生理生化特征以及细胞壁化学分析，将菌株AL-04 归为杀真菌素链霉菌（Streptomyces fungicidicus）。

3 讨论

活性菌株初筛法多采用平皿拮抗测定和活体植株测定，前者虽反映离体抑菌作用，但与盆栽及大田植株测定结果相关性很低，而后者工作量又太大，影响筛选进度。本研究采用蔬菜离体叶片平皿培养测定法则可弥补两者不足之处，它可以把体外无效、体内有效的活性菌株筛选出来，极大地缩短初筛周期并提高筛选的准确性。在该方法的基础上再进行盆栽及大田测定，可显著减少工作量，提高筛选水平。

实践证明，新型高效农用抗生素的发现与新的筛选模型的构建关系紧密。如以观察稻瘟菌分生孢子或菌丝形态生长异常为指标的简易微管测试体系［16］，筛选出多种具有抗有丝分裂、抗真菌活性的新化合物，其中rhizoxin 和fusaridin A 已开发为抗肿瘤、抗真菌新药［17，18］。国内的林厚文等［19］利用该模型筛选到海兔中抗有丝分裂活性组分；鲍时翔等［20］参照该模型建立了镰刀菌筛选模型，并将其与肿瘤细胞毒筛选模型组合，应用于海洋微生物抗肿瘤活性物质的筛选。孢子萌发法筛选病原真菌的拮抗菌株时，常常需要培育病原菌的孢子，但其培养存在费时费力和离体条件毒性不高的弊端，能否采用更简洁的方法用于活性菌株的筛选，特别是应用于大量备选菌株库的初筛工作，是菌株筛选过程中亟待解决的问题。本研究借鉴稻瘟菌筛选模型，以黑曲霉、木霉和青霉3 种常见非植物病原真菌和植物病原真菌辣椒疫霉作为指示菌，进行孢子萌发抑制试验。结果显示，对4 种指示菌孢子萌发抑制率均达到70.0%以上的活性菌株占供试菌株总数的38.5%，这部分活性菌株对3 种非植物病原真菌孢子萌发抑制率达到73%-98%，同时对病原真菌的孢子萌发抑制率也达到了70%-88%，说明活性菌株对非病原真菌和病原真菌的抑制作用存在一定的偶联关系，而且黑曲霉、木霉和青霉产孢子比辣椒疫霉产孢子更加容易，检测时从加样到观察所需时间更短（前者只需6-10 h，而后者一般要12-16 h）。因此，上述试验结果提供了一个农用抗生素筛选模型的新思路，即活性菌株若对易培养真菌孢子萌发有抑制作用，其很可能对病原真菌孢子也存在一定的抑制作用。因此，在实际操作过程中，可以选择易培养的非病原真菌作为初筛工作的靶标菌，从而缩短筛选周期。本研究结果是对该思路的一个初步探索，其验证工作还有待进一步的研究。

4 结论

参照稻瘟菌筛选模型，以非植物病原真菌和植物病原真菌作为指示菌，筛选到一株具有广谱的抗菌活性的菌株AL-04，其对几种常见的园艺植物土传病害病原真菌都有较强的抑制效果，抑制率超过70.0%，其中对辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）抑制率高达93.0%，有较高的应用价值。经形态、培养特征、生理生化特征、全细胞壁氨基酸和糖型分析以及16S rDNA 序列聚类分析，将AL-04 鉴定为杀真菌素链霉菌（Streptomyces fungicidicus）。

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