响应面法优化倒卵叶五加多糖铁 (Ⅲ)合成工艺条件研究

赵 鹏， 张婷婷， 张丽华， 宋 逍

(陕西中医学院药学院，陕西 咸阳712046)

缺铁性贫血(iron deficiency anaemia，IDA)是一种常见的营养性疾病。目前，临床上用于治疗IDA 的药物主要是硫酸亚铁制剂，其存在生物利用度低和较大的胃肠刺激性等缺点［1］。因此急需开发出一种含铁量高、溶解性好及副作用小的新型补铁剂来满足临床治疗IDA 的需要。

近年来，以三价铁为核心，生物活性多糖为配体的多糖铁络合物正成为研制新型补铁剂研究热点，研究者们开发出了一系列不同多糖配体的多糖铁类络合物［2-6］，而以力蜚能为代表的多糖铁复合物制剂则早已进入临床应用阶段［7］。相较于传统补铁剂，多糖铁络合物具有副作用小、配合性稳定、溶解度好，含铁量高等优点，对治疗缺铁性贫血具有较好的疗效，此外，作为配体的多糖一般都具有提高免疫、抗氧化性等多方面的生物活性，在补铁的同时，还可进一步提高机体免疫力，因此其是一种比较理想的补铁剂［8］。

倒卵叶五加Acanthopanax obovatus Hoo 属五加科五加属植物，分布于陕西、宁夏、甘肃等地［9］。倒卵叶五加多糖是其主要的活性成分之一，具有明显的调节机体免疫、抗氧化性等生物活性［10-11］。鉴于此，本研究以陕西产倒卵叶五加为原料，从中提取倒卵叶五加多糖，与铁(Ⅲ)进行络合反应，研究制备倒卵叶五加多糖铁(Ⅲ)络合物(缩写为AHC，下同)的合成工艺路线，利用响应面法优化了其合成工艺条件，并对AHC 的理化性质进行了初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 倒卵叶五加购自陕西省西安万寿路中药材批发市场(经陕西中医学院宋逍副教授鉴定为倒卵叶五加Acanthopanax obovatus Hoo 的干燥根、茎);柠檬酸三钠、三氯化铁、无水乙醇、三氯甲烷、石油醚(60 ～90 ℃)、氢氧化钠、邻菲啰啉、Vc、K4［Fe(CN)6］ 等试剂均为分析纯。

UV-2501PC 紫外可见分光光度仪(日本岛津公司);FA2004 电子天平(上海精科天平厂);4K15 台式离心机(Sigma 公司);ALPHA1-4 型真空冷冻干燥机(德国Christ公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 倒卵叶五加多糖的制备 将倒卵叶五加的根茎在80 ℃下干燥，粉碎后过60 目筛。再将其用石油醚在回流下脱脂2 次，过滤，滤渣晾干后，用双蒸水，按料液比1 ∶15 (g/mL)80 ℃下提取2 次，提取液合并，再按1 g 生药材浓缩为1 mL 进行浓缩，浓缩液经脱蛋白、脱色处理后，用4 倍体积量的无水乙醇醇沉，即得倒卵叶五加粗多糖，将其用截留分子质量为3 500 透析袋流动水透析48 h，透析液浓缩，再醇沉，即得制备倒卵叶五加多糖铁的原料，此时多糖的含有量为84.9%。

1.2.2 AHC 的合成 称取一定量的倒卵叶五加多糖和柠檬酸三钠，溶于双蒸水中，水浴加热至一定温度，此时，逐滴交替加入2 mol/L FeCl3溶液和20%NaOH 溶液，控制溶液的pH 在合适的范围内。当上述反应液中生成不溶性的沉淀时，即停止加入FeCl3和NaOH，继续反应1 h 后冷却。将反应液过滤，除去沉淀，滤液用4 倍量的无水乙醇沉静至过夜后过滤，将滤饼用无水乙醇和乙醚洗涤后，真空干燥，即得AHC，具体工艺路线如图1 所示。

1.2.3 AHC 制备工艺条件优化 本研究按照Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，在单因素试验的基础之上，以倒卵叶五加多糖铁中铁的含有量作为响应值，采用反应温度、配料比(多糖与柠檬酸三钠的质量比)和pH 等三个对倒卵叶五加多糖铁中含铁量影响较大的因素进行响应面优化实验，实验因素和水平设计如表1 所示。

图1 倒卵叶五加多糖铁(Ⅲ)络合物制备工艺流程

表1 实验因素水平

1.2.4 AHC 中含铁量测定 参照文献［2］，采用邻菲罗啉分光光度法测定AHC 中铁的含有量。

1.2.5 AHC 的还原性试验 参照文献［2］，采用邻菲罗啉比色法对AHC 进行还原性试验。

2 结果与讨论

2.1 AHC 合成工艺

2.1.1 响应面优化分析 本研究依据单因素实验结论，以AHC 的含铁量为指标，应用响应面设计法优化AHC 的合成工艺，响应面分析结果见表2 ～3。

表2 响应面分析实验方案及实验结果

采用Design-Expert 7.01 软件对响应面优化试验得到的结果进行研究，研究结果见表2，按照各因素对试验结果的影响进行二次方程拟合，拟合得到下式:

表3 方差分析

根据表3 中所得到的分析结果能够发现，回归方程的F 值为109.32，其显著水平远远低于0.05，这说明，利用响应面法拟合得到的试验模型显著性极高，利用拟合模型回归得到的二次方程，分析其因变量和自变量之间的线性相关系数后可以看到，r =286.04/288.08 =0.992 9，这一点说明用该数学模型来评估各相关因素对AHC 中含铁量的影响真实可靠。从表3 的方差分析结果可以看出，响应面试验组合的各单因素中，对AHC 中含铁量影响最大的是配料比，其次是反应温度，pH 的影响最小，为不显著影响因素。

对回归方程 (1)求一阶偏导［12］，可得出:X1=-0.49，X2=0.87，X3=0.18;由此可得到按照回归模型预测合成AHC 的最优工艺条件是:反应温度为75.1 ℃，配料比为3.87，pH 值为8.09，在此工艺条件下，预测得到的AHC 中含铁量为19.45%。

2.1.2 验证试验 根据预测的实验结果，并从实际工艺操作方便考虑，微调AHC 合成的最佳工艺条件为:温度为75 ℃，配料比为3.9，pH 为8.0，在此工艺条件下重复操作3 次，得到的AHC 中含铁量的平均值为19.43%，这说明通过回归方程预测得到的工艺条件与实际操作工艺条件十分吻合。

2.2 AHC 的理化性质

2.2.1 AHC 的一般理化性质 AHC 的外观呈红棕色，是无定形粉末，熔点较高(＞300 ℃)，难溶于常见的有机溶剂，易溶于水，得到的溶液为中性。将K4［Fe(CN)6］ 溶液滴入AHC 的水溶液中，结果未发生Fe (Ⅲ)离子的显色反应，这说明AHC 是以络合物的形式存在于水溶液，没有游离的Fe3+存在。当调节AHC 的水溶液的pH 4 ～12 范围内变动时，发现无沉降、水解现象出现，这说明AHC 具有较好的稳定性。

2.2.2 AHC 的还原性试验 称取0.005 g 的AHC，溶于一定量的双蒸水中，加入10%的Vc 水溶液5 mL 和0.12%的邻菲罗啉溶液5 mL，NaAc 溶液5 mL，用50 mL 的量瓶定容后，在恒温37 ℃下不断搅拌，在不同的时间点取样，以不加入AHC 的溶液做空白，510 nm 波长处测定吸光度(A)。结果见图2。

图2 AHC 与Vc 反应体系的A-t 曲 线

由图2 可知，AHC 在3 h 内基本能被Vc 逐渐还原成Fe(Ⅱ)，可见AHC 具有良好的溶出被还原性能，这说明AHC 作为口服补铁剂时，可被还原性物质将其中的Fe(Ⅲ)还原为Fe (Ⅱ)，从而被机体所吸收，具有较好的生物利用度。

3 结论

3.1 本研究利用柠檬酸三钠-三氯化铁法得到了AHC，并通过响应面法确定了合成的最优工艺条件为:温度为75 ℃，配料比为3.9，pH 为8.0，在此工艺条件下重复操作3 次，得到的AHC 中含铁量的平均值为19.43%。

3.2 通过对AHC 的理化性质和还原性试验可知AHC 的水溶液中不含游离的Fe3+，这说明其具有较小的胃肠道刺激的副作用，而且其在3 h 内基本能被Vc 还原为Fe (II)，具有较好的生物利用度。

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