东北地区五味子栽培品种的质量分析

李先宽， 王 冰 ， 郑艳超， 宋 新， 丁 璞， 刘 枞

(辽宁中医药大学，辽宁 大连116600)

五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis (Turcz.)Baill 的干燥成熟果实［1］，是历代药典收载的常用药材。作为一种传统中药，常用于治疗干咳，哮喘，盗汗，遗精和慢性腹泻等［2-3］。现代研究证明，五味子具有多种有效成分，常用于保肝［4-5］、抗衰老、抗氧化［6-7］、提高免疫能力［8-9］、调节中枢神经系统［10-12］等作用。五味子是辽宁省最重要的道地药材，由于近些年五味子的广泛种植，其广泛的种源，即种质资源来源不一致是影响五味子质量的一个重要因素［13］。本课题组于2012年9 月～10 月收集了东北地区主要栽培品种，包括红珍珠、长白红等共10 份样品。本研究应用苯酚-硫酸比色法和高效液相色谱法两种方法，分别对五味子多糖和木脂素两类主要有效成分进行定量测定和分析，目的对东北地区不同的五味子栽培品种进行质量研究，为保护和合理利用五味子种质资源提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 UV-1750 紫外分光光度计(SHIMADZU)、恒温水浴锅(北京永光明医疗仪器厂)、鼓风恒温干燥箱(沈阳市医疗器械厂)、索氏提取器、Agilent1100 高效液相色谱仪，VWD 检测器(G1314A)，四元泵(G1311A) (美国Agilent 公司)、电子天平 (瑞士 Mettler Toledo AG285，AE240)、KQ-250 型超声清洗器(昆山超声仪器有限公司)。

1.2 试剂 无水葡萄糖、对照品五味子醇甲(110857-200507)、五味子甲素(110764-200609)、五味子乙素(110765-200710)(购自中国食品药品检定研究院)，五味子醇乙、五味子丙素(购自成都思科华生物技术有限公司)。重精馏苯酚、硫酸、无水乙醇均为分析纯，甲醇为色谱纯和分析纯，乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水。

1.3 药材 样品来源见表1，经辽宁中医药大学王冰教授鉴定为北五味子果实。取适量室内自然晾干至一定程度的果实样品，将果肉和种子小心剥离后得果肉样品。果肉和果实样品在室内自然晾干，粉碎后过60 目筛，称量前将样品置于烘箱中，40 ℃下干燥24 h 后取出，放入干燥器中备用。

表1 五味子样品来源Tab.1 Source of medicinal materials

2 方法

2.1 多糖测定方法

2.1.1 葡萄糖标准曲线的绘制 精密称量干燥至恒定质量的葡萄糖对照品10 mg，加适量水溶解，转移至100 mL 量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，配成质量浓度为0.1 mg/mL 的葡萄糖对照溶液，备用。精密量取葡萄糖对照溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、1.0 mL 于具塞试管中，分别加水补足至1.0 mL，再分别加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀后加浓硫酸5 mL，充分摇匀，放入冰水浴中，所有样品加完显色剂后同时放入40 ℃水浴锅中，反应30 min，取出，放冷至室温后，在485 nm 处测其吸光度，以多糖质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，对所得数据进行线性回归，得标准曲线方程:A =10.428X -0.021 3，相关系数r = 0.996。实验结果表明在0.01 ～0.1 mg/mL范围内质量浓度与吸光度之间呈良好的线性关系。这符合Lambert-Beer 定律，表明根据吸光度来计算样品中粗多糖量是可靠的。

2.1.2 供试品溶液制备 取干燥后的果实样品粉末(60 目)0.20 g，精密称定，用80%乙醇浸泡过夜，索氏提取器中80%乙醇回流提取2 h，粉末挥干溶剂后，以水为溶媒超声提取55 min，料液比1 ∶30，提取温度65 ℃，取出，放冷至室温后，减压抽滤，滤液定容于250 mL 量瓶中，摇匀，得粗多糖供试品溶液。

2.2 木脂素测定方法

2.2.1 HPLC 色谱条件 Agilent TC-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)-水(B)梯度洗脱(0 ～15 min，50% A;15 ～25 min，75% A;25 ～30 min，58% A;30 ～32 min，58% A;32 ～35 min，65% A;35 ～45 min，65%A)。检测波长250 nm，体积流量1 mL/min，柱温35 ℃，进样量10 μL。高效液相色谱图见图1。

图1 木脂素类对照品及样品的HPLC 图谱Fig.1 Chromatograms of sample and reference substances of lignans

2.2.2 对照品溶液制备 分别精确称取一定量干燥至恒定质量的5 种对照品，分别用甲醇溶解并定容于25 mL 量瓶中，制备成五味子醇甲(0.205 2 mg/mL)、五味子醇乙(0.209 2 mg/mL)、五味子甲素(0.197 6 mg/mL)、五味子乙素 (0.203 6 mg/mL)、五味子丙素(0.202 8 mg/mL)的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液制备 取干燥后的样品粉末(60 目)约0.25 g，精密称定，置50 mL 锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声提取30 min，取出，放冷至室温后，加甲醇补足失质量，摇匀，滤过。滤液作为供试品溶液［14］。

2.2.4 木脂素标准曲线的绘制 分别吸取五味子醇甲 (143.64 μg/mL)、五味子醇乙 (33.47 μg/mL)、五味子甲素(69.16 μg/mL)、五味子乙素(87.55 μg/mL)、五味子丙素(6.08 μg/mL)对照品溶液0.63、1.25、2.5、5 mL 分别置10 mL量瓶中，加甲醇稀释到刻度，摇匀，分别精密吸取各质量浓度对照品溶液10 μL，依次注入高效液相色谱仪，以各成分的峰面积平均值为纵坐标(Y)，其对应进样量(μg)为横坐标(X)，绘制标准曲线，做线性回归。五味子醇甲在0.13 ～1.44 μg 范围内呈良好的线性关系，其回归方程为Y =0.035X- 0.736 4 (r = 0.999);五味子醇乙在0.03 ～0.33 μg 范围内呈良好的线性关系，其回归方程为Y=0.039 3X -0.000 6 (r =0.999);五味子甲素在0.06 ～0.69 μg 范围内呈良好的线性关系，其回归方程为Y = 0.034 9X + 0.315 (r =0.999);五味子乙素在0.08 ～0.88 μg 范围内呈良好的线性关系，其回归方程为Y = 0.039X -1.050 5 (r =0.999);五味子丙素在0.01 ～0.06 μg 范围内呈良好的线性关系，其回归方程为Y =0.054 4X-0.054 (r=0.999)。

2.3 样品测定

2.3.1 样品中粗多糖测定 每份多糖供试品溶液平行测定3 次，显色过程同“2.1.1”项。同时做一空白，在485 nm 处测其吸光度。按下式计算多糖的量，多糖量(%) = (A +0.021 3) ×250 ×100 /10.428 W。不同类型多糖测定结果见表2。

2.3.2 样品中木脂素测定 称取“1.3”项下备用的不同栽培品种五味子粉末0.25 g，精密称定，按“2.2.3”项下制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定。每一样品平行进样3 次，以外标法中的标准曲线法计算样品各成分的量。不同农家类型测定结果见表3。其中，总量的值为5 种指标成分含有量的和。

表2 多糖测定结果Tab.2 Results of the contents with polysaccharide

2.3.3 果肉中木脂素量占果实中木脂素量的比例对不同五味子栽培品种，果实样品和相对应的果肉样品中所测的木脂素指标成分进行比较分析，结果见表4。

3 讨论

红珍珠为我国选育唯一获得登记的五味子品种，样品7 和样品8 均为红珍珠，其采集时间相近，但所处的生态环境不同，五味子植株不同的生态环境可能是导致红珍珠1 和红珍珠2 样品之间多糖百分含有量相差1%的主要原因。红珍珠二代是在红珍珠的基础上，自主选育的栽培品种，与红珍珠来相比，其果穗长，果穗密，果粒大，果肉厚，多糖百分含有量在所有样品中最高为7.18%。凤选系列为辽宁凤城大梨树培育的栽培品种，在采集样品时，凤选1 ～3 号均已成熟，凤选4 号样品距离最佳采收期提前约1 个星期，测定结果表明凤选4 号果实样品中多糖含有量低于凤选1 ～3 号。五味子样品多糖百分含有量平均值为5.83%，表明栽培品种样品中多糖含有量是非常丰富的。然而，在五味子收获季节，为了便于采摘、运输和晾晒等，果实中多糖往往还未达到峰值便被采摘。五味子多糖药理活性强，在保肝、增强免疫等方面具有良好的应用前景［15］。探寻不同栽培品种五味子果实多糖积累最适宜的生态环境，确定最佳的采收期是非常重要的。

表3 木脂素测定结果(mg/g，n=3)Tab.3 Results of the contents with lignans (mg/g，n=3)

表4 果肉中木脂素成分占果实中木脂素成分的比例(mg/mg)Tab.4 Proportions (pulp/fruit)of the contents with the 5 kinds of index ingredients (mg/mg)

由表3 可知，所有栽培品种果实样品中五味子醇甲含有量均达到了《中国药典》的标准［1］。五味子果实中果肉与所对应的种子干粒重比，以1 为准上下波动［16］，故由表3 和表4 可知，5 种成分在种子中的含有量要明显高于果肉中的含有量;表明五味子木脂素成分主要存在于种子中。实验结果表明五味子醇乙和五味子丙素在果肉中的量占果实中量的比例要明显高于其他3 种成分，这2 种成分比例平均值分别为0.270 和0.211。因此五味子药材在与其他药物配伍使用时，为提高木脂素类成分的有效利用率，可考虑将药材适当粉碎后入药。

白果五味子为五味子的变异类型［17］，在辽宁省凤城市和东港市等五味子基地均有少量分布，据本课题组统计，白果五味子植株所占基地五味子植株的比例大约在1/3 000 左右，多年跟踪观察发现其遗传性状较为稳定。目前关于白果五味子的研究较少，本研究对其多糖和木脂素两类成分同时进行了测定分析，结果表明白果五味子样品多糖含有量为5.57%，与五味子栽培样品相比无明显差异;木脂素类成分五味子乙素在果实样品中含有量相对其他样品较小，同时，五味子乙素在其果肉样品中没有被检出，其他木脂素类指标成分含有量与五味子栽培样品相比无明显差异。

本研究对东北地区五味子主要栽培品种中多糖类和木脂素类有效成分进行了研究，对综合评价栽培五味子的品质，指导今后五味子的育种工作和对种质资源的合理保护具有重要的意义。

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