HPLC 法测定枳壳不同炮制品中活性成分

张金莲， 曾昭君， 李志强， 魏 莹， 杨武亮， 余书琦

(江西中医药大学，江西 南昌330004)

枳壳为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L. 及其栽培变种的干燥未成熟果实，7 月果皮尚绿时采收，自中部横切为两半，晒干或低温干燥，具有理气宽中，行滞消胀的功效，主要用于胸胁气滞，胀满疼痛，食积不化，痰饮内停，脏器下垂［1］。枳壳的主要化学成分有黄酮类化合物、挥发油、香豆素类及少量的生物碱类等［2］，是枳壳药理作用研究的主要物质基础。而其主要活性成分包括黄酮苷类和脂溶性成分，其中黄酮苷类主要有柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷等，脂溶性成分主要有桔皮素、川陈皮素、水合橘皮内酯、橘皮内酯、马尔敏和葡萄内酯［3］。有研究报道［4-5］枳壳脂溶性部位提取物对胃肠平滑肌有双向调节作用，小剂量对正常小鼠胃肠运动有促进作用，大剂量则有抑制作用。本实验采用RP-HPLC 法对生品、药典法、樟帮生品、樟帮法及建昌帮法枳壳中9 个活性成分进行定量测定比较，为合理制定其炮制工艺及控制炮制品的质量提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Ultimate 3000 高效液相色谱仪(Ultimate3000 柱温箱，VWD 检测器，Chromeleon 7.10色谱工作站)，Sartoris. BT224S (万分之一天平)，Mettle AE240 (瑞士，十万分之一天平)。KQ-3200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，YF-111 二两装高速中药粉碎机(瑞安市永历制药机械有限公司)，SZ-93 自动双重纯水蒸馏器(上海雅荣生化仪器设备有限公司)，SHZ-D (Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市华仪器有限责任公司)，RE-52 旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 材料 柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橘皮内酯、橘皮内酯、马尔敏、川陈皮素、桔皮素和葡萄内酯对照品(自制，1H-NMR、13C-NMR、ESIMS 鉴定，HPLC 峰面积归一化法计算纯度不低于98.0%)，乙腈(Tedia 产，色谱纯)，甲醇为色谱纯，水为双蒸水，其余试剂均为分析纯。枳壳药材为2012 年夏采集于江西省新干县三湖镇，经江西中医药大学杨武亮教授鉴定为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L. 的干燥未成熟果实。

2 方法与结果

2.1 不同炮制品的制备

2.1.1 生品 取原药材，挖去内瓤，洗净，润软，切薄片，低温干燥。

2.1.2 药典法［1］取生品枳壳片，先将炒制容器加热，至撒入麸皮即刻烟起，随即投入枳壳片，迅速翻动，炒至表面呈黄色或深黄色时，取出，筛去麸皮，放凉。每100 kg 枳壳，用麸皮10 ～15 kg。

2.1.3 樟(树)帮生品［6］取原药材，挖去内瓤，洗净，润过夜，用铁锚压扁，再上木架3 ～5 d，稍见霉点使对合成扁半圆形，切成0.2 cm 厚的“凤眼片”，晒干。

2.1.4 樟(树)帮法［6］将炒制容器加热，取麦麸撒于锅内，待浓白烟起，加入晒干的樟帮生品枳壳片，不断翻动，炒至淡黄色时取出，筛去焦麸皮，放凉。每100 kg 枳壳，用麸皮5 ～10 kg。

2.1.5 建昌帮法［7］取原药材，加热水浸泡5 ～10 min，沥干，用湿麻布闷润1d，润软后挖去内瓤，用铁锚压扁，再上木架定形，晒2 ～3 d，至表皮水分干燥后横切成“人字片”，再晒至全干。再将炒制容器加热，取蜜麸撒于锅内，待浓白烟起，加入晒干的枳壳片，快速翻炒1 ～2 min，炒至淡黄色时快速取出，筛去焦麸皮，入容器内密闭转黄色即得。每100 kg 枳壳，用蜜麸50 kg。

2.2 供试品溶液的制备

2.2.1 黄酮苷类制备［8］取枳壳饮片粉末(40目)约0.5 g，置100 mL 圆底烧瓶中，加甲醇水浴加热回流1.5 h 后，趁热滤过，滤液置50 mL 量瓶中，药渣再提取2 次(每次加10 mL 甲醇提取10 min)，滤液置同一量瓶中，待冷却后加甲醇至刻度，摇匀，准确取出5 mL 转移至25 mL 量瓶中，用甲醇定容，0.45 μm 滤膜过滤，续滤液为供试品溶液。

2.2.2 脂溶性成分制备 取枳壳炮制品中粉约0.5 g，精密称定，置100 mL 具塞锥形瓶中，精密加入甲醇40 mL 水浴回流1.5 h，过滤合并醇提液，用旋转蒸发仪减压回收甲醇，得浸膏，加入40 mL蒸馏水，加热溶解，分次洗涤(2 ∶1 ∶1)成水混悬液，待水液冷却后，移至分液漏斗中，以等体积三氯甲烷萃取两次，收集下层脂溶性部位。减压回收溶剂至干。残渣用色谱纯甲醇溶解并洗涤，定容于10 mL 量瓶中，过0.45 μm 的微孔滤膜，取续滤液即得。

2.3 对照品溶液的制备 取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橘皮内酯、橘皮内酯、马尔敏、川陈皮素、桔皮素和葡萄内酯对照品适量，精密称定，加甲醇分别配制得到柚皮苷155.93 μg/mL、橙皮苷138.36 μg/mL 和新橙皮苷87.19 μg/mL 的混合对照品溶液;水合橘皮内酯58.08 μg/mL、橘皮内酯38.29 μg/mL、马尔敏19.90 μg/mL、川陈皮素35.01 μg/mL、桔皮素34.02 μg/mL 和葡萄内酯29.50 μg/mL 的混合对照品溶液。

2.4 色谱条件

2.4.1 黄 酮 苷类 测 定［8］Diamonsil C18色 谱 柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-水(磷酸调pH 3) (23 ∶77)，检测波长283 nm，体积流量1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量10 μL。样品及对照品色谱图见图1。

图1 对照品(A)、样品(B)和甲醇溶剂(C)HPLC 图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)，samples (B)and methanol (C)

2.4.2 脂溶性成分测定［3］Diamonsil C18色谱柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇(A)-水(B)，体积流量1.0 mL/min，柱温25 ℃，检测波长324 nm，进样量10 μL。二元梯度洗脱:0 ～6 min，49%A;6 ～15 min，49% ～75%A;15 ～26 min，75% ～100%A;26 ～30 min，100%A。样品及对照品色谱图见图2。

图2 对照品(A)和样品(B)HPLC 图Fig.2 HPLC chromatograms of reference substances(A)and samples (B)

2.5 线性关系考察 精密吸取脂溶性成分各对照品适量进样，分别按上述色谱条件进行测定，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，得水合橘皮内酯、橘皮内酯、马尔敏、川陈皮素、桔皮素和葡萄内酯的线性方程分别为y =26.535x +5.691 (r =0.999 4)，y=29.893x +3.93 (r =0.999 9)，y =25.097x + 1.796 (r = 0.999 7)，y = 34.703x +3.401 (r = 0.999 8)，y = 42.995x + 5.407 (r =0.999 9)，y =25.302x +3.505 (r =0.999 5)，线性范围分别为35.8 ～180.6 ng、22.7 ～949 ng、12.7 ～668 ng、20.6 ～110.5 ng、20.7 ～1 059 ng、7.5 ～617 ng。

2.6 精密度试验 精密移取各对照品适量，进样，分别按上述色谱条件测定，结果水合橘皮内酯、橘皮内酯、马尔敏、川陈皮素、桔皮素和葡萄内酯峰面积RSD (n =6)分别为2.0%，1.8%、2.1%、1.4%、1.3%、2.5%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验 取脂溶性供试品溶液适量，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样，按相应色谱条件测定，结果水合橘皮内酯、橘皮内酯、马尔敏、川陈皮素、桔皮素和葡萄内酯峰面积RSD 分别为0.9%、1.4%、1.7%、0.8%、2.0%、2.6%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.8 重复性试验 按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液各5 份，按相应的色谱条件进行测定，结果水合橘皮内酯、橘皮内酯、马尔敏、川陈皮素、桔皮素和葡萄内酯含有量的RSD 分别为1.7%、2.2%、2.3%、1.6%、1.9%、2.3%，表明该方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验 取已知含有量的枳壳粉末0.25 g，精密称定，共6 份，各精密加入水合橘皮内酯、橘皮内酯、马尔敏、川陈皮素、桔皮素和葡萄内酯质量浓度分别为0.81、0.74、0.17、0.64、0.42、0.16 g/L 的混合对照品溶液1 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.2”项下条件测定，计算平均回收率分别为97.2%(RSD 2.8%)，98.7% (RSD 2.5%)，99.0%(RSD 2.7%)，98.3% (RSD 2.8%)，103.6%(RSD 2.6%)，101.7% (RSD 2.7%)。

2.10 枳壳不同炮制品中活性成分测定 分别取不同炮制品枳壳，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液， “2.4”项下色谱条件，采用外标一点法计算枳壳不同炮制品中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、水合橘皮内酯、橘皮内酯、马尔敏、川陈皮素、桔皮素和葡萄内酯的量。结果见表1。

表1 样品测定结果(n=3)Tab.1 Content determination of samples (n=3)

3 讨论

实验结果表明，不同炮制方法枳壳饮片中黄酮苷类及脂溶性成分均存在差异。与生品相比，枳壳经药典法、樟帮法及建昌帮法炮制后其黄酮苷类成分柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷的量均增加，而经发酵的樟帮生品黄酮苷类成分的量减少，其黄酮苷类含有量依次为:建昌帮法﹥樟帮法﹥药典法﹥生品﹥樟帮生品;而与生品相比，枳壳经药典法、樟帮法及建昌帮法炮制后其脂溶性成分含有量水合橘皮内酯、橘皮内酯、马尔敏、川陈皮素、桔皮素均呈下降趋势，而经发酵的樟帮生品各脂溶性成分呈升高趋势，脂溶性成分含有量依次为:樟帮生品﹥生品﹥药典法﹥樟帮法﹥建昌帮法。从实验结果可知，枳壳经麸或蜜麸加热炒制后黄酮苷类成分呈上升趋势，脂溶性成分呈下降趋势;而经发酵霉变后枳壳黄酮苷类成分的量明显下降，脂溶性成分的量明显上升。这可为今后进一步研究枳壳炮制工艺和枳壳炮制后活性成分的转化提供一定参考依据。

枳壳的炮制目的主要是“缓燥增效”。传统中医药理论认为“枳壳麸炒以缓和其峻烈之性而免伤元气”［9］， “麦麸皮制，抑酷性勿伤上膈”［10］。而目前研究亦认为枳壳麸炒可降其挥发油的含有量，去除刺激成分，缓和燥性［11］。而其燥性是否与黄酮苷类与脂溶性成分的增减或是各活性成分之间的比例变化相关，有待选择科学合理的药理模型进一步深入研究。

枳壳的主要功效是理气宽中，行滞消胀。《中国药典》2010 年版以黄酮苷类成分含有量为判定枳壳质量优劣的指标成分，实验结果表明，建昌帮法炮制枳壳中黄酮苷类成分的量高于其他各炮制法，故枳壳建昌帮法炮制值得推广应用。文献［4-5，12］报道枳壳脂溶性部位提取物对胃肠平滑肌有双向调节作用，小剂量对正常小鼠胃肠运动有促进作用，大剂量则有抑制作用。枳壳的临床常用剂量是3 ～10 g，在常规剂量内枳壳不同炮制品的脂溶性成分的煎出量对胃肠运动是促进还是抑制，未见有相关文献报道，可对其进一步研究，从而为探索枳壳的炮制机理及控制炮制品的质量提供更为科学合理的依据。

［1］ 国家药典委员会. 中华人民共和国药典:2010 年版一部［S］. 北京:中国医药科技出版社，2010:229-231.

［2］ 徐 欢，陈海芳，介 磊，等. 枳实、枳壳的化学成分及胃肠动力研究概述［J］. 江西中医学院，2009，21(1):42-43.

［3］ 李正红，陈海芳，骆利平，等. 江枳壳不同采收期活性成分HPLC 含量测定［J］. 中药材，2013，36(1):28-31.

［4］ 陈海芳，魏 玲，袁金斌，等. RP-HPLC 法测定枳壳中5个脂溶性成分的含量［J］. 药物分析杂志，2010，30(9):1610-1614.

［5］ 张普照，黎艳刚，涂明珠，等. 葡萄内酯和马尔敏的合成及活性研究［J］. 时珍国医国药，2010，21 (8):1851-1853.

［6］ 龚千锋. 樟树中药炮制全书［M］. 南昌:江西科技出版社，1990:238.

［7］ 梅开丰，张祯祥，上官贤，等. 建昌帮中药传统炮制法［M］. 江西省南城县整理建昌帮中药传统小组，1986.

［8］ 张金莲，何 敏，谢一辉，等. 高效液相色谱法测定枳壳饮片中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量［J］. 中国实验方剂学杂志，2010，16(6):68-70.

［9］ 明·吴 崐，罗周彦. 医宗粹言:卷四药性论［M］. 新文豐出版公司，1982:527-528.

［10］ 明·陈嘉谟. 本草蒙荃［M］. 王淑民等点校. 北京:人民卫生出版社，1988:221-222.

［11］ 曾 红，姜淑玲，梁兆昌，等. 中药枳壳炮制研究进展［J］. 井冈山学院学报:自然科学，2008，29(8):72-75.

［12］ 陈海芳，魏 玲，袁金斌，等. 枳壳中脂溶性部位有效成分提取工艺的研究［J］. 中成药，2010，32 (9):1510-1513.