载汉黄芩素的mPEG-PLGA 纳米粒的制备及体外评价

沈 熊， 许根英， 董 颖， 梁 健， 吕迁洲 ， 许 青

(复旦大学附属中山医院药剂科，上海200032)

汉黄芩素(wogonin，Wo)是从唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi、半枝莲Scutellaria barbata D. Don 以及夹竹桃科植物鳝藤Anodendron affine (Hook. et Arn)Druce 等植物中分离或者通过合成得到的黄酮类化合物［1］，具有抗炎、抗肿瘤等广泛的治疗作用［1-4］。同很多黄酮类化合物一样，汉黄芩素存在水溶性差、吸收后易被代谢等缺陷［5-6］。文献报道将汉黄芩素制成脂质体［7］、固体脂质纳米粒［8］、白蛋白微球等［9］可以达到缓释、靶向给药、提高生物利用度等效果。同时也报道了血浆对汉黄芩素脂质体的稳定性有一定影响，血浆中的调理素等成分可能影响脂质体的缓释效果［7］。因此，选择适当的载体制备汉黄芩素纳米粒，在保留缓释的基础上增加长循环特性，提高药物稳定性，以提高药物吸收和生物利用度［10-11］，有助于汉黄芩素的开发利用。

乳酸-羟基乙酸共聚物［poly (lactic-co-glycolic acid)，PLGA］是一类可生物降解的高分子材料，具有良好的生物相容性和体内安全性，已被美国FDA 录用为药用辅料，被广泛用做纳米载药系统的载体。在PLGA 纳米粒表面修饰亲水性材料，如聚乙二醇(PEG)、聚氧乙烯(PEO)等，可以提高其亲水性，静脉注射给药后可以降低被血浆中酶系统降解的程度，且不易被单核吞噬细胞系统识别吞噬，延长药物的体内循环时间，提高生物利用度［12］。

本实验以单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(mPEG-PLGA)为载体，采用溶剂扩散法制备载汉黄芩素的纳米粒(Wo-mPEG-PLGA NPs)，考察其形态、载药性能、血清稳定性和体外释放行为等指标。

1 仪器与材料

Agilent 1200 高效液相色谱仪(美国Agilent 公司);Zetasizer Nano ZS 纳米粒度及Zeta 电位分析仪(英国Malvern 公司);JY 92-II DN 超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司);Eppendorf 5430 R 小型台式高速离心机［艾本德(上海)国际贸易有限公司］;VOS-90AG 真空干燥箱［施都凯仪器设备 (上海)有限公司］;Tecnai G220 透射电子显微镜 (荷兰 FEI 公司);UV760CRT 双光束紫外可见分光光度计(日本岛津);SHZ-B 型恒温水浴振荡器(上海跃进医疗器械厂)。

汉黄芩素原料药(上海同田生物技术有限公司，纯度≥98.5%，批号20121210);汉黄芩素对照品(中国食品药品检定研究院，批号110773—201011);单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物(mPEG-PLGA，mPEG 相对分子质量为2 000，PLGA，相对分子质量为30 000，LA ∶GA =75 ∶25，济南岱罡生物科技有限公司);胎牛血清(美国Sigma 公司);泊洛沙姆188 (Pluronic F-68，德国BASF 公司);甲醇为色谱纯，水为双蒸水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 纳米粒的制备 采用溶剂扩散法制备纳米粒，室温下精密称取2.5 mg 汉黄芩素和50 mg mPEGPLGA 溶解于2.5 mL 丙酮作为有机相，磁力搅拌下注入到25 mL 含有0.5% (m/V)Pluronic F-68的水相中，加完后超声45 s (输出功率200 W)，继续搅拌20 min，60 ℃磁力搅拌下除去有机溶剂，0.45 μm 微孔滤膜滤过，低温超速离心(21 000×g，45 min，4 ℃)，弃去上清液，收集纳米粒，加10 mL 水分散后再次离心，如此重复2 次，取纳米粒减压干燥(-0.08 MPa，50 ℃)，即得汉黄芩素纳米粒，称定质量，记为mNP。取该纳米粒约20 mg，精密称定，置10 mL 量瓶中，加适量水超声分散，加水稀释至刻度，摇匀，记为“汉黄芩素纳米混悬液A”。

2.2 纳米粒的表征

2.2.1 扫描电镜(SEM)观察 取1 ～2 滴汉黄芩素纳米混悬液A 滴于铜网上，用1.0%磷钨酸溶液染色，室温晾干后置透射电镜下观察，可见所得Wo-mPEG-PLGA NPs 呈球形，表面较光滑，大小均匀，分散性好，粒径约100 nm。

2.2.2 粒径及ζ电位 取汉黄芩素纳米混悬液A 加水稀释5 倍，用粒度仪测定粒径和ζ电位。测得Wo-mPEG-PLGA NPs 的平均粒径为 (112 ± 33)nm，ζ电位为(-23.71 ±2.95)mV (n=3)。

2.2.3 血清稳定性 按文献方法［13］，取1 mL 汉黄芩素纳米混悬液A 与等体积50% 胎牛血清混合均匀，于37 ℃孵育24 h，取样，于检测波长750 nm，以50%胎牛血清透光率(T%)为100%，测得孵育后的溶液透光率为(99.02 ±0.27)% (n =3)，未见纳米粒凝聚现象，说明37 ℃下24 h 内纳米粒在血清中保持稳定。

2.3 Wo-mPEG-PLGA NPs 载药量的测定

2.3.1 HPLC 条件和方法学验证 按文献方法［7，14］，采用HPLC 法测定Wo-PLGA NPs 的载药量。Luna C18色谱柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm，美国菲罗门公司);流动相为甲醇-水-三氟乙酸(60 ∶40 ∶0.05);体积流量1 mL/min，检测波长275 nm;柱温30 ℃;进样量20 μL。

取汉黄芩素约10 mg，精密称定。加适量甲醇溶解，并稀释至 25 mL，制成质量浓度为400 μg/mL的贮备液，用流动相稀释成质量浓度为0.1 ～5.0 μg/mL 的系列汉黄芩素对照品溶液，按上述方法进样分析，以峰面积对汉黄芩素质量浓度做线性回归，制备标准曲线。结果显示汉黄芩素在此质量浓度范围内线性关系良好，回归方程为:A=4.68 ×103+3.12 ×105C (r=0.999 8)，其中A为汉黄芩素色谱峰的峰面积，C 为对照品质量浓度(μg/mL)。以汉黄芩素峰面积计，低、中、高3 种质量浓度对照品溶液(0.2、2.5、5.0 μg/mL)的日内和日间相对标准偏差 (RSD)均小于2%(n=5);方法回收率分别为 (99.21 ±1.62)%、(101.67 ±1.76)% 和(100.45 ±1.20)%，方法的准确性良好。

2.3.2 载药量的测定 取“2.1”项下制得纳米粒10 mg，精密称定，加入2 mL 乙腈-水(9 ∶1)溶解载体材料使汉黄芩素释放出，转移至10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取1 mL转移至10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，按“2.3.1”项下方法进样，测定汉黄芩素量，记为mE，即纳米粒包封的汉黄芩素量，根据下列公式计算载药量(Drug Loading，DL):

其中，mNP为测定取用的纳米粒的质量(10 mg)，得纳米粒的平均载药量为(3.27 ±0.04)%(n=3)。

2.4 Wo-mPEG-PLGA NPs 的体外释放试验 采用透析法考察纳米粒的体外释药。按“2.1”项下方法制备，得纳米粒约42.7 mg，精密称定，加适量水超声分散，转移至10 mL 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得每1 mL 约含140 μg 汉黄芩素的混悬液，记为“汉黄芩素纳米混悬液B”。

精密吸取0.5 mL 汉黄芩素纳米混悬液B，加入1 mL磷酸盐缓冲液(0.05 mol/L，pH 7.4，以下简称PBS)，混合均匀，置透析袋(截留分子质量15 000)中，两端扎紧，置50 mL PBS 中，(37 ±0.5)℃下恒温水浴中水平振荡(100 次/min，振幅20 mm)，定时取透析外液，同时补充等量等温的PBS 至释放介质，将取出的溶液离心后按“2.3.1”项下条件测定，计算汉黄芩素量和累积释放率。

精密吸取0.5 mL 汉黄芩素纳米混悬液B，加入1 mL血浆，漩涡混匀，置透析袋中，同法测定累积释放率，考察血浆对纳米粒释放的影响。

取汉黄芩素原药约5 mg，精密称定，加适量助溶剂溶解于水中，制成约为140 μg/mL 的混悬液，同法考察累积释放率，结果见图1。

图1 体外释放曲线(n=6)Fig.1 Profile for in vitro release (n=6)

结果可见，汉黄芩素溶液从透析袋中迅速释放，在4 h 内释放完全。分散于PBS 的Wo-mPEGPLGA NPs 在0 ～3 h 释药较快，3 h 至12 h 释放减慢，12 h 以后逐渐趋于平缓，24 h 累积释放率约为39%，说明Wo-mPEG-PLGA NPs 具有缓释效应。纳米粒先与血浆混合后，其释放曲线与纳米粒分散于PBS 中的释放行为类似，在0 ～3 h 的各时间点基本重叠，3 ～12 h 的释放度略高于前者，24 h 时累积释放率约为42%，说明血浆对纳米粒的释放度影响不明显。

3 讨论

本研究用以mPEG-PLGA 为载体材料，采用溶剂扩散法制备了载汉黄芩素的纳米粒，表征纳米粒，并考察其体外释放特性。

纳米粒溶液在血清中的凝聚特性是其稳定性的重要指标［13］。本研究采用纳米混悬液在50%胎牛血清中孵育后测定透光率(T%)的方法考察其稳定性。因为透光率(T%)的范围为0 ～100%，便于直观比较，所以采用测定透光率(T%)而不是吸收度(A)的方法。以50%胎牛血清透光率为100%，纳米溶液孵育24 h 后透光率为(99.02 ±0.27)% (n =3)，可见纳米溶液在血清中凝聚程度轻微，稳定性良好。

体外释放度试验结果表明，汉黄芩素原药在4 h内释放完全，这与文献报道一致［7］。而WomPEG-PLGA NPs 在4 h 时的释放度约为21%，呈现明显的缓释效果。纳米粒分散于血浆后进行的释放试验表明，血浆对纳米粒的释放影响不明显，其释放行为与纳米粒分散于PBS 基本一致。结合稳定性试验结果推测，以mPEG-PLGA 为载体制备汉黄芩素纳米粒可以减少血浆调理素的影响，从而具备长循环的特性［15］。接下来可进行体内试验来进一步验证其缓释和长循环的特性，为汉黄芩素的新剂型研发提供帮助。

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