周络通胶囊激活转录因子Nrf2抑制糖尿病周围神经病变小鼠氧化应激

张会欣，王 超，朱慧明，崔庆飞，何奇龙，高学东，王宏涛

(1.河北以岭医药研究院国家中医药管理局重点研究室，河北石家庄 050035;2.河北省人民医院临床医学研究中心，河北石家庄 050051;3.石家庄以岭药业股份有限公司，河北石家庄 050035)

糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病慢性并发症之一，其发病机制尚未阐明，但大量研究表明氧化应激在DPN的发生中起到了重要作用［1－2］。NF-E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)是一种新近发现的转录因子，它可以启动多种抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的活化，对抗氧化应激所致的疾病损伤［3］，但Nrf2在DPN中氧化应激的作用报道并不多见。周络通胶囊为已获临床批件的治疗DPN的中药新药，由黄芪、桂枝、当归、生地、细辛等12味中药组成，具有通络祛瘀止痛之功效，动物实验表明周络通对DPN显示了很好的疗效［4］。本实验用周络通胶囊治疗DPN小鼠，观察Nrf2核转位对DPN氧化应激损伤的作用。

1 材料与方法

1.1 动物 KK/Upj-Ay小鼠，30～40 g;C57BL/6小鼠，25 ～30 g，均为 SPF 级，♂，12 周龄，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，动物合格证号:0225144。

1.2 药品与试剂 周络通胶囊由黄芪、桂枝、当归、生地、细辛等12味中药组成，石家庄以岭药业股份有限公司生产;糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)试剂盒、丙二醛 (malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase;glutathione peroxidase，GSH-Px)、过氧化氢酶(hydrogen peroxidase，CAT)试剂盒购自南京建成生物研究所;Nrf2、血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl cysteine synthetase，γ-GCS)引物由上海生工生物技术公司合成;兔抗Nrf2多克隆抗体、兔抗HO-1多克隆抗体、兔抗γ-GCS多克隆抗体购自美国Abcam公司。

1.3 仪器 BL-420F生理记录仪(成都泰盟);7080全自动生化分析仪(日立);7300荧光定量PCR仪(ABI公司);凝胶成像分析仪(Biorad)。

1.4 动物分组与给药 KK/Upj-Ay小鼠，40只，按空腹血糖值(FBG)分为4组:模型组(Model)、周络通高、中、低剂量组(ZLT-H，ZLT-M，ZLT-L)，另设C57BL/6小鼠为对照组(Control)，每组10只动物。周络通高、中、低剂量组分别灌胃给予6.85、3.43、1.71 g生药·kg－1的周络通胶囊，对照组和模型组给予等体积的蒸馏水，每日1次，连续12周。

1.5 坐骨神经传导速度(MNCV)测定［5］给药结束，小鼠麻醉后俯卧位固定，连接生理记录仪，在右侧坐骨切迹插入刺激电极，在踝部(远端)和左足底第2趾间分别插入记录电极，记录双通道复合动作电位(以两对记录电极间距离S(mm)除以两通道复合动作电位潜伏期之差△t(ms)来计算MNCV)。每间隔1 min，重复电刺激3次取其平均值，计算其MNCV。

1.6 血液指标测定 每月1次尾静脉采血，罗氏血糖仪测定FBG;给药结束取血，按试剂盒的说明书测定HbA1c含量;比色法测定SOD、GSH-Px活性和CAT、MDA 含量。

1.7 荧光定量PCR方法测定坐骨神经Nrf2、HO-1、γ-GCS mRNA的表达 取坐骨神经，提取RNA，1 μg RNA按说明书进行逆转录反应，荧光定量PCR仪扩增，Nrf2引物:上游:5'-AGTGACTCGGAAATGGAGGAG-3'，下游:5'-TGTGCTGGCTGTGCTTTAGG-3'，产物片段77bp;HO-1引物:上游:5'-GCTGGTGATGGCTTCCTTGT-3'，下游:5'-ACTGGGTTCTGCTTGTTGCG-3'，产物片段 75bp;γ-GCS 引物:上游:5'-GCACATCTACCACGCAGTCA-3'，下游:5'-CAGAGTC TCAAGAACATCGCC-3'，产物片段142bp;GAPDH引物:上 游:5'-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3'，下游:5'-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3'，产物片段143 bp。扩增条件:94℃，5 min预变性，94℃ 30 s变性、55℃ 30 s退火、72℃ 30 s延伸，进行40个循环的扩增，于每个循环的延伸阶段收集荧光信号。扩增结束后进入分析界面，以GAPDH作为内参照，根据每个样本扩增曲线的Ct值计算各目的基因表达水平的相对定量值，对照组设置为1，最终结果计为与对照组进行比较后的相对定量值RQ用于统计分析。

1.8 Western blot法检测坐骨神经总 Nrf2、核Nrf2、HO-1、γ-GCS蛋白的表达 取坐骨神经20 mg，加入200 μl裂解液提取总蛋白质(核内蛋白)，Bradford法测定蛋白浓度，取40 μg蛋白上样，10%SDS-PAGE电泳转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，一抗(1∶200)孵育过夜，加入相应的二抗(1∶1 000)，漂洗，化学发光法显色，对条带进行吸光度积分扫描。GAPDH作为内参照。用目的蛋白吸光度值/内参照吸光度值的比值进行比较。

2 结果

2.1 FBG及HbA1c的变化 模型组FBG明显高于对照组，周络通治疗后FBG逐渐下降，高剂量组治疗12周后差异有统计学意义(P＜0.05);其中，模型组、周络通低、中、高剂量组各有1只小鼠死亡。给药治疗12周后，模型组HbA1c明显高于正常组，周络通高剂量组比模型组HbA1c明显降低(P＜0.01)。见 Tab 1，2。

Tab 1Effects of ZLT on FBG in KK mice(±s)

Tab 1Effects of ZLT on FBG in KK mice(±s)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group

Group FBG/mmol·L －1 Before 4 wk 8 wk 12 wk Control 5.99 ±1.33＊＊ 4.98 ±0.89＊＊ 5.97 ±1.01＊＊ 6.12 ±0.98＊＊Model 12.59 ±2.68 11.92 ±2.84 12.57 ±3.51 11.47 ±2.89 ZLT-L 12.06 ±2.08 11.96 ±1.64 11.80 ±1.91 10.32 ±1.89 ZLT-M 13.50 ±1.50 13.29 ±2.87 10.92 ±2.90 10.18 ±2.77 ZLT-H 12.08 ±2.13 11.92 ±2.28 10.13 ±1.32 8.58 ±1.47*

2.2 坐骨神经传导速度的变化 模型组比对照组MNCV明显减慢(P＜0.01)，周络通低、中、高剂量组MNCV与模型组比较明显增快(P＜0.05，P＜0.01)。见Tab 2。

Tab 2Effects of ZLT on MNCV in KK mice(±s)

Tab 2Effects of ZLT on MNCV in KK mice(±s)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group

Group n HbA1c/% MNCV/m·s －1 Control 10 3.98 ±0.78＊＊ 24.85 ±4.23＊＊Model 9 9.53 ±1.29 5.20 ±1.49 ZLT-L 9 9.12 ±0.99 7.71 ±1.81*ZLT-M 9 8.90 ±0.82 9.74 ±1.83＊＊ZLT-H 9 6.35 ±1.14＊＊ 10.71 ±1.81＊＊

2.3 氧化指标的变化 模型组比对照组 SOD、GSH-Px、CAT活性均明显下降(P＜0.01)，MDA 含量明显升高(P＜0.01);与模型组比较，周络通低剂量组MDA含量降低(P＜0.05)，中剂量组 SOD、GSH-Px活性上升(P＜0.05)，MDA含量降低(P＜0.05)，高剂量组 SOD、GSH-Px、CAT活性均上升(P＜0.01)，MDA含量降低(P＜0.01)。见Tab 3。

Tab 3 Effects of ZLT on SOD，GSH-Px，CAT and MDA level in KK mice(±s)

Tab 3 Effects of ZLT on SOD，GSH-Px，CAT and MDA level in KK mice(±s)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs model group

Group n SOD/U·ml－1 GSH-Px/U·ml－1 CAT/U·g－1 MDA/μmol·L －1 Control 10 80.34 ±12.39＊＊ 91.68±20.39＊＊ 219.95±32.86＊＊ 5.59 ±1.84＊＊Model 9 44.61 ±10.56 45.62 ±10.69 117.28 ±25.64 12.68 ±3.86 ZLT-L 9 49.26 ±9.84 52.69 ±10.58 130.64 ±28.64 9.11 ±2.06*ZLT-M 9 60.81 ±10.97* 59.88 ±11.35* 136.52 ±27.92 8.59 ±1.94*ZLT-H 9 68.95 ±11.76＊＊ 70.66±14.21＊＊ 164.27±30.23＊＊ 7.65 ±1.54＊＊

2.4 坐骨神经 Nrf2、HO-1、γ-GCS mRNA 表达的变化 模型组HO-1、γ-GCS mRNA表达明显高于对照组(P＜0.01)，与模型组比较，周络通低、中、高剂组HO-1 mRNA表达明显上升(P＜0.05，P＜0.01)，周络通低、高剂量组γ-GCS mRNA表达明显上升(P＜0.01)，Nrf2 mRNA表达在各组无差异(P＞0.05)。见 Tab 4，Fig 1。

Tab 4 Effects of ZLT on Nrf2，HO-1，γ-GCS mRNA expression in KK mice(±s，n=3)

Tab 4 Effects of ZLT on Nrf2，HO-1，γ-GCS mRNA expression in KK mice(±s，n=3)

*P＜0.05，＊＊ P＜0.01 vs model group

Group NRF HO-1 γ-GCS Control 1.02 ±0.10 1.02 ±0.13＊＊ 1.02 ±0.11＊＊Model 1.00 ±0.10 2.94 ±0.31 4.21 ±0.45 ZLT-L 1.16 ±0.12 3.78 ±0.40* 7.01 ±0.70＊＊ZLT-M 1.23 ±0.11 4.01 ±0.35＊＊ 5.35 ±0.47 ZLT-H 0.98 ±0.08 5.70 ±0.42＊＊ 8.48 ±0.61＊＊

Fig 1 PCR amplification curve of Nrf2，HO-1，γ-GCS and GAPDH

2.5 坐骨神经总 Nrf2、核 Nrf2、HO-1、γ-GCS 蛋白表达的变化 模型组核Nrf2、HO-1、γ-GCS蛋白表达明显高于对照组(P＜0.05，P＜0.01)，与模型组比较，周络通中、高剂量组核 Nrf2、HO-1、γ-GCS蛋白表达明显上升(P＜0.05，P＜0.01)，总Nrf2蛋白表达在各组无差异(P＞0.05)。见Tab 5，Fig 2。

Tab 5 Effects of ZLT on Nrf2，HO-1，γ-GCS protein expression in KK mice(±s，n=3)

Tab 5 Effects of ZLT on Nrf2，HO-1，γ-GCS protein expression in KK mice(±s，n=3)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group

Group Total Nrf2 Intranuclear Nrf2 HO-1 γ-GCS Control0.55 ±0.06 0.38 ±0.05*0.37 ±0.05＊＊ 0.30 ±0.04*Model 0.58 ±0.07 0.59 ±0.08 0.61 ±0.06 0.47 ±0.06 ZLT-L 0.61 ±0.07 0.65 ±0.09 0.67 ±0.09 0.52 ±0.06 ZLT-M 0.57 ±0.08 0.81 ±0.10*0.82 ±0.11* 0.75 ±0.07＊＊ZLT-H 0.59 ±0.06 0.93 ±0.12*0.88 ±0.09* 0.89 ±0.09＊＊

3 讨论

在机体组织正常情况下，氧化系统和抗氧化系统处于动态平衡状态。当机体受到有害刺激时，如高血糖，可以通过多种途径介导产生过多的氧自由基，导致氧化与抗氧化系统失衡，引起组织损伤［6］。机体内存在有非酶抗氧化系统和酶抗氧化系统，前者包括维生素 C、维生素 E、谷胱甘肽等，后者有SOD、CAT、GSH-Px等，抗氧化系统防御功能损害也会导致组织损伤。本实验发现，在DPN小鼠模型中，血清MDA含量明显升高，SOD、GSH-Px、CAT活性明显下降，说明高糖状态下，自由基产生增多和(或)抗氧化防御功能下降导致了DPN小鼠氧化应激的产生。周络通干预组在治疗12周时能降低糖化血红蛋白，提高坐骨神经传导速度，并能降低血清中MDA的含量，提高SOD、GSH-Px、CAT活性，同时光镜观察到周络通能改善坐骨神经的轴索退变，崩解病理改变，提示周络通能有效减低DPN小鼠的氧化应激损伤，发挥其保护作用。

Fig 2 Effects of ZLT on Nrf2，HO-1，γ-GCS protein expression

Nrf2 是一种转录因子，最新的研究显示［7－8］，敲除Nrf2基因的小鼠易于发生氧化应激，机体内的酶抗氧化系统有可能是通过Nrf2的转录激活启动的。正常情况下，Nrf2和它的细胞质接头蛋白Keap1作为细胞抗氧化反应的中枢调节者，偶联被封闭在细胞质中，在氧化应激状态下，Keap1构型发生变化，Nrf2与Keap1分离，Nrf2向细胞核中转运和活化，启动其下游多种抗氧化蛋白表达和Ⅱ相解毒酶的合成，如 HO-1、γ-GCS、SOD、CAT 等，减轻氧化应激引起的损伤［9］，已有文献［10－11］报道了一些化学物质或药物能够激活Nrf2、启动对靶基因的调控，减轻组织损伤。

我们的实验观察到DPN模型小鼠坐骨神经中核内Nrf2蛋白表达明显升高，同时 HO-1、γ-GCS mRNA和蛋白表达亦明显升高，表明高糖引起的DPN导致了 Nrf2核转录，进而导致下游 HO-1、γ-GCS表达升高，给予周络通干预后，核内Nrf2、HO-1、γ-GCS表达进一步升高，表明周络通能有效促进Nrf2的核转位，进而增加了抗氧化蛋白HO-1和γ-GCS的表达，提示周络通对DPN小鼠的抗氧化应激损伤与其促进Nrf2核转位有关。

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