蜂胶毛胶中总黄酮、高良姜素和白杨素含量分析△

夏正燕，冯瑛，潘建明

(浙江省中药研究所，浙江 杭州 310012)

蜂胶毛胶中总黄酮、高良姜素和白杨素含量分析△

夏正燕*，冯瑛，潘建明

(浙江省中药研究所，浙江 杭州 310012)

目的：建立蜂胶毛胶中总黄酮以及高良姜素、白杨素含量测定方法，测定不同基原毛胶中上述各指标的含量。方法：以芦丁为对照品，采用UV法测定总黄酮含量，检测波长为415 nm；用HPLC同时测定高良姜素、白杨素含量，采用Welchrom C18柱，以甲醇-0.15%磷酸溶液梯度洗脱，检测波长为268 nm。结果：总黄酮在0～1.248 mg线性关系良好，r=0.999 9(n=6)，平均回收率为98.82%，RSD=1.45%。高良姜素、白杨素分别在0.089～0.445 0，0.115～0.580 μg线性关系良好，r均达到1.000，平均回收率分别为99.03%、99.32%，RSD分别为1.10%、1.72%。结论：该方法准确、可靠、简便易行，可用于蜂胶毛胶的定量分析，为蜂胶毛胶、其提取物以及蜂胶制品的质量评价和控制提供了依据。

蜂胶毛胶；总黄酮；高良姜素；白杨素；基原；含量分析

蜂胶是蜜蜂采集植物茎、腋芽的树脂并混入花粉、自身分泌物和蜂蜡，混合而成的一种具芳香气味的胶状固体物，其主要化学成分为黄酮类、萜烯类、酚酸类化合物等，其中黄酮类成分含量高达10%。从生物学活性角度看，蜂胶具有广谱抗菌、抗氧化、抗肿瘤、调节血脂血糖等十分广泛的生物学作用[1]，故而成为独特而宝贵的纯天然保健食品资源和药源，具有广阔的应用前景。

黄酮类成分是蜂胶品质的主要评价指标，而高良姜素、白杨素只有在天然原生蜂胶中才含有，《中国药典》关于蜂胶功效成分检测，将其作为含量测定项目[2]。为此，笔者进行了本项研究[3-5]，以总黄酮、高良姜素和白杨素的含量来综合评价蜂胶的质量，可用于蜂胶的定量分析，为蜂胶、其提取物以及蜂胶制品的质量控制和评价提供了依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪，DAD检测器；Shimadzu UV-2550紫外-可见分光光度计；KQ-100DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 材料

芦丁、高良姜素、白杨素对照品(批号分别为0080-9504，111699-200501，111701-200501，均购自中国食品药品检定研究院)；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

蜂胶购自吉林、浙江、安徽、山东等地蜂农，经浙江省中药研究所杨苏蓓教授鉴定为蜂胶。

2 方法与结果

2.1 样品的提取

取药材粉末(过65目筛)约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入95%乙醇50 mL，称重，50 ℃超声提取2次，每次30 min，放冷，称重，以95%乙醇补足原重，摇匀，滤过，即得。

2.2 总黄酮含量测定[6]

2.2.1 对照品溶液的配制 精密称取芦丁对照品适量，加无水乙醇溶解配成浓度为0.2 mg·mL-1的溶液，即得。

2.2.2 标准曲线的制备 分别精密吸取2.2.1项下的对照品溶液0，1，2，3，4，5，6 mL，置50 mL量瓶中，加95%乙醇至总体积为15 mL，依次加入硝酸铝溶液(0.1 g·mL-1)1 mL，醋酸钾溶液(9.8 g·L-1)1 mL，加水至刻度，摇匀，静置1 h。于415 nm处，以试剂空白为参比，测定吸光度。以总黄酮含量为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得回归方程Y=0.615 2X-0.000 2，r=0.999 9，线性范围为0～1.248 mg。

2.2.3 供试品溶液的测定

2.2.3.1 供试品溶液的制备 精密吸取2.1项下滤液1 mL，置50 mL量瓶中，加95%乙醇至总体积为15 mL，按2.2.2项下制备。

2.2.3.2 空白试验 精密吸取2.1项下滤液1 mL，置于50 mL量瓶中，加95%乙醇至总体积为15 mL，加水稀释至刻度，摇匀。

2.2.3.3 测定 以空白试验作参比，在415 nm处测定吸光度，以芦丁计算其总黄酮的含量。

2.2.4 精密度试验 吸取对照品溶液6份，每份3 mL，按照2.2.2项下操作，分别测定吸光度(A)值，计算得RSD=1.03%。

2.2.5 稳定性试验 取同一供试品(河南产)，按2.2.3项下操作，每隔20 min测定1次吸光度值，连续测定100 min，计算得A值的RSD=1.57%。表明供试品溶液的A值在100 min内稳定。

2.2.6 重复性试验 取同一供试品(河南产)6份，按2.2.3项下操作，分别测定A值，得总黄酮含量的RSD=1.46%。

2.2.7 加样回收率试验 取药材粉末(过65目筛)约0.15 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入芦丁对照品溶液(3.20 mg·mL-1)5 mL，按2.1及2.2.3项下操作，平行测定6份，计算得总黄酮平均回收率为98.82%，RSD=1.45%。

2.2.8 各基原蜂胶中总黄酮的测定 取各基原样品粉末(过65目筛)约0.3 g，精密称定，按2.1项下提取后，按2.2.3项下操作，计算总黄酮含量。结果见表3。

2.3 HPLC测定高良姜素和白杨素的含量

2.3.1 色谱条件 色谱柱：Welchrom C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：以甲醇为流动相A，以0.15%磷酸溶液为流动相B，按表1规定进行梯度洗脱；检测波长：268 nm；流速：1 mL·min-1；柱温：30 ℃。在上述条件下，高良姜素、白杨素的保留时间分别为18,22 min，理论塔板数不低于3 000，高良姜素、白杨素与其他组分达到基线分离，见图1。

表1 流动相梯度洗脱时间表

1.白杨素 2.高良姜素图1 对照品(A)和河南蜂胶供试品(B)HPLC图

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取高良姜素、白杨素对照品适量，加甲醇溶解，制成每1 mL分别含约18,23 μg的混合溶液，作为对照品溶液；另取白杨素对照品，精密称定，加甲醇溶解制成每1 mL约含30 μg，作为白杨素对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备 取2.1项下的滤液，精密吸取2.5 mL，置10 mL量瓶中，加95%乙醇定容至刻度，摇匀，静置，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3.4 线性范围考察 精密吸取高良姜素、白杨素混合对照品溶液5.0，10，15，20，25 μL进样，以峰面积积分值为纵坐标(Y)，分别以高良姜素、白杨素对照品量为横坐标(X，μg)，绘制标准曲线，分别得回归方程为Y=3 288.9X-21.8，r=1.000；Y=4 674.2X-13.718，r=1.000。结果表明高良姜素、白杨素分别在0.089～0.445 0 μg，0.115～0.580 μg呈良好的线性关系。

2.3.5 精密度试验 取同一对照品溶液重复进样5次，测定高良姜素及白杨素峰面积值，其RSD分别为0.54%，0.44%，结果表明仪器精密度良好。

2.3.6 重复性试验 按拟定的方法对同一样品(河南产)进行6次平行测定，结果表明，高良姜素、白杨素含量的RSD分别为0.72%、0.56%。

2.3.7 稳定性试验 取样品(河南产)适量，按上述方法制成供试品溶液，放置0，2，4，8，12，24 h，分别进行测定，结果高良姜素、白杨素含量的RSD分别为0.70%、0.89%(n=6)，表明样品溶液放置24 h内稳定。

2.3.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品(河南产)6份，分别精密加入高良姜素、白杨素混合对照品(浓度为2.90，3.00 mg·mL-1)1.0 mL，按样品测定方法制成供试品溶液，依法进行测定，计算回收率，结果见表2。

表2 高良姜素、白杨素回收率试验

2.3.9 样品含量测定 取样品，按供试品溶液制备方法制备供试液，依上述色谱条件测定。各基原蜂胶样品测定结果见表3。

表3 不同基原蜂胶样品总黄酮、高良姜素及白杨素含量(n=3) /mg·g-1

3 讨论

实验曾考察了不同的提取溶媒：甲醇、丙酮、95%乙醇、80%乙醇、65%乙醇，结果显示95%乙醇提取效果最好。

曾对超声、回流、索氏提取方法进行了比较，结果表明超声法提取较完全，且超声提取2次，每次30 min较为合适。

曾对流动相的比例进行过考察，发现以甲醇-0.15%磷酸(64∶36)为流动相，分离较好且峰形佳，但分析周期较长；而采用梯度洗脱，能大大地缩短分析时间，节省了人力、物力。

不同基原蜂胶中总黄酮含量有差异，白杨素和高良姜素的含量差别更大，大部分蜂胶都是白杨素含量高于高良姜素，各指标与基原的相关性仍有待于进一步研究。

[1] 朱恩圆，窦玉玲，魏东芝，等.蜂胶HPLC指纹图谱及质量控制[J].中国中药杂志,2005,30(18):1423.

[2] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社,2010:336.

[3] 王小平，林励，陈振霖，等.HPLC法测定不同产地蜂胶中高良姜素的含量[J].中草药,2007,30(5):560.

[4] 黄焕婷，黄海潮.不同产地蜂胶中总黄酮的提取及含量测定[J].广东化工,2010,37(205):215.

[5] 曹炜，符军放，索志荣，等.蜂胶中白杨素和高良姜素的HPLC分析[J].药物分析杂志,2007,27(4):522.

[6] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会.蜂胶中总黄酮含量的测定方法分光光度比色法[S].GB/T 20574-2006.北京:中国标准出版社,2006.

关于举办中药资源化学研究与资源有效利用的新思路新方法培训班的通知

中药资源是中药产业发展赖以生存的基础，是中药材生产与质量保证的源头，关系到中医药行业的可持续发展，为了加深中医药行业相关从业人员和教学科研工作者对中药资源学科建设及国家中长期发展战略的认识，准确把握中药资源学科的内涵和研究范畴，掌握中药资源学科相关领域科研思路与方法，培养中药资源学科人才队伍，不断提高学科的建设水平，确保中医药事业健康、稳定、可持续发展，由国家中医药管理局主办，南京中医药大学承办的国家级中医药继续教育项目“中药资源化学研究与资源有效利用的新思路新方法暨中药资源与开发专业系列规划教材培训学习班”(项目编号2013100104062)将于2013年11月22日～25日在南京举行。此次培训对象包括中医药行业中药士、中药师、工程师、农艺师、生产技术人员，各大专院校及科研院所从事中药资源及相关专业的教学、科研工作人员等，参会代表可获国家级Ⅰ类继续教育学分证书(10分)。具体会议内容详见http://yxy.njutcm.edu.cn/show.asp?cid=12&id=21172046。

联系人：严辉13512537853 刘圣金13770653305

传真：025-85811524报名邮箱： tryw2010@126.com

通信地址：南京市仙林大学城仙林大道138号4号信箱邮编：210023

DeterminationofTotalFlavonoids,GalanginandChrysininPropolisofDifferentOrigins

XIA Zheng-yan*,FENG Ying，PAN Jian-ming

(ZhejiangResearchInstituteofTraditionalChineseMedcine，Hangzhou310023,China)

Objective： To establish UV and HPLC methods for determination of total flavonoids,galangin and chrysin in Propolis.Methods： UV method was used to determine total flavonoids,and the detection wavelength was 415 nm.The analysis of Galangin and Chrysin was performed on a Welchrom C18column with a gradient solvent system of methanol-0.15% phosphoric acid solution,and the detection wavelength was 268 nm.Results: The linear range of rutin was 0～1.248 mg(r=0.999 9),and the average recovery was 98.82% with RSD 1.45%.The linear range of galangin and chrysin in propolis were 0.089～0.445 0 μg and 0.115～0.580 μg,both with good correlation(r=1.000).The average recovery were 99.03% for galangin and 99.32% for chrysin,and RSD were 1.10% and 1.72%,respectively(n=6).Conclusion：The methods are simple and reliable for quantitative analysis of propolis,its extracts and products,and can be used for quality control and evaluation.

Propolis；Total flavonoids；Galangin；Chrysin；Origin；Content determination

2013-01-09)

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浙江省分析测试科技计划项目(2011C37066)

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夏正燕，E-mail：xzhengyan@gmail.com