HPLC法测定秋水仙药材中秋水仙碱

李 岩， 李晓静，， 程雪梅， 王峥涛， 王长虹*

(1.新疆医科大学药学院药剂教研室，新疆乌鲁木齐830011;2.上海中医药大学中药研究所;中药标准化教育部重点实验室;中药新资源与质量标准综合评价国家中医药管理局重点研究室;上海市复方中药重点实验室，上海201210)

维药秋水仙为百合科植物秋水仙Colchicum autumnale L．的干燥鳞茎，收载于卫生部药品标准《维吾尔药分册》，其性质为二级干，三级热，具有生干生热，祛风止痛，通阻除黄、祛寒助阳的功效，用于治疗大小关节骨痛(风湿性和类风湿性关节炎)、肝炎、黄疸等症［1-3］。秋水仙碱 (colchicine)是秋水仙中主要有效成分，具有抗痛风、抗肿瘤、抗肝炎等多种药理作用，对某些癌症和原发性痛风有特异性作用［4-6］，但毒性较大［7］。部颁秋水仙药材标准中仅规定了性状、显微鉴别等质量控制项目，尚无定量检测方法和指标［1］。目前文献报道的有关秋水仙碱的定量测定以HPLC法为主，但均是对秋水仙碱片［8-9］或秋水仙碱原料［10］、丽江山慈姑［11］、及含秋水仙的复方制剂［12-13］中的秋水仙碱的定量测定，而对秋水仙药材中秋水仙碱的定量测定方法尚未见报道。因此，本实验采用HPLC法对秋水仙药材中秋水仙碱进行测定，为药材的质量控制提供科学依据。

1 仪器与试药

Waters2695高效液相色谱仪 (Empower Pro色谱数据工作站，996二极管阵列检测器，600四元泵，717plus自动进样器，在线脱气机，Waters Co．);分析色谱柱Symmetrix ODS-H(4.6 mm ×250 mm，5μm);BP211D Sartorius电子天平 (Sartourius Co．GM);超纯水器 (Millipore公司);KQ-250DB型数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司)。

秋水仙 (批号 20111002-1、20111002-2、20111002-3，由安徽德昌药业饮片有限公司提供，产地为新疆;批号Y090130、Y090186、Y091126、Y110621，新疆维吾尔药业有限责任公司提供，进口)，由吴立宏副研究员鉴定为百合科植物秋水仙Colchicum autumnale L．的干燥鳞茎，凭证标本存放于上海中药标准化研究中心标本室;秋水仙碱对照品 (中国药品生物制品检定所，批号:101176-201001);乙腈 (色谱纯，Fisher);甲醇为色谱纯;水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取秋水仙碱对照品12.50 mg，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得500μg/mL秋水仙碱对照品贮备液。

2.2 供试品溶液的制备 取秋水仙药材粉末 (过4号筛)约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量，超声处理60min(功率250W，频率50 kHz)，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，滤液用微孔滤膜 (0.45μm)滤过，即得。

2.3 色谱条件 Symmetrix ODS-H色谱柱 (4.6 mm×250 mm，5μm);流动相为乙腈-0.1% 三氟乙酸 (28:72);检测波长350 nm;体积流量1.0 mL/min;柱温30℃。在此条件下，秋水仙碱与样品中其他成分达到基线分离 (见图1)。

2.4 线性关系的考察 精密量取秋水仙碱对照品贮备液0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL分别置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制得质量浓度为2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0μg/mL的秋水仙碱对照品溶液。取以上各质量浓度秋水仙碱对照品溶液10μL进样，记录色谱图，以峰面积 (Y)为纵坐标，秋水仙碱对照品质量浓度 (X)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y=22 704X+16 218，r=0.999 9(n=7)，线性范围为2.5～160 μg/mL。

图1 秋水仙碱对照品 (A)和秋水仙供试品(B)的HPLC图

2.5 最低检测限 将秋水仙碱对照品溶液按逐步稀释法稀释，测定其最低检测限。信噪比约为3∶1时，秋水仙碱的最低检测限5.00 ng。

2.6 稳定性考察 取供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24、72 h测定，计算秋水仙碱的含有量及RSD，结果RSD为0.94%。

2.7 精密度试验 精密吸取秋水仙碱对照品贮备液0.1、1.0、3.0 mL分别置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度。分别于1 d内间隔相等时间分别测定5次计算日内精密度;连续测定3 d，进行日间精密度测试结果见表1。日内精密度RSD分别为0.86%、0.54%、0.43%;日间精密度RSD分别为1.35%、0.64%、0.50%;日内和日间精密度均小于1.5%，说明日内、日间精密度良好。

表1 日内、日间精密度试验结果

2.8 重复性试验 取同一批样品，按供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，计算秋水仙碱的含有量及RSD，结果RSD为0.96%，表明方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验 取已准确测定的秋水仙样品粉末约0.5 g，共9份，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入各对照品溶液适量，按供试品溶液的制备方法处理，测定，计算加样回收率，结果见表2。结果表明，高、中、低3个质量浓度的加样回收率为 (96.37±1.02)%，RSD小于2.0%。

表2 回收率测定结果(n=3)

2.10 样品测定 将3批秋水仙药材按2.2项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下，分别进样10μL测定，记录各个峰面积，分别计算秋水仙中秋水仙碱的量，结果见表3。

表3 样品测定结果

3 讨论

3.1 本实验比较了用20、50、100倍的溶剂量，分别以回流、超声等方法进行提取，结果以超声提取法简便快捷，提取效果好。50倍溶剂量和100倍溶剂量相比，提取效果无差别，因此，选用相当于药材量的50倍溶剂量超声提取法制备供试品溶液。

3.2 文献报道HPLC法用于秋水仙碱测定的报道中，大多采用磷酸二氢钾-甲醇系统作为流动相［8，12-13］，而本实验采用不含盐的两相系统 (乙腈-0.1%三氟乙酸)作为流动相，组成简单，且能更好的保护色谱柱。

3.3 本实验对7批不同来源的秋水仙药材进行了测定，不同批次的药材中秋水仙碱量差异较大。对药材中秋水仙碱建立适宜的限度标准，从而对药材进行质量控制具有重要的意义。从结果可以看出，进口药材中秋水仙碱量比国产相对偏低，其原因还待于进一步研究。本测定方法简便、快速、准确、稳定性良好，可为秋水仙的质量控制提供依据。

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