基于HPLC特征指纹图谱的蒲黄炭的鉴别研究

刘瑀曦， 王荣荣， 齐 文， 刘晓秋

(沈阳药科大学中药学院，辽宁沈阳110016)

蒲黄Typhae Pollen为香蒲科植物水烛香蒲Typha angustifolia L．、东方香蒲 Typha orientalis Presl或同属植物的干燥花粉。主产于内蒙古、浙江、江苏和东北三省，蒲黄中含有黄酮、甾类、烷类、酸类等多种化合物［1-2］。蒲黄生用性滑，能行血消瘀;蒲黄炭用味甘涩，性微寒，有收敛之性，专止血［3-7］。

《中国药典》2010年版 (一部)中首次明确中成药制剂处方为饮片入药，解决了长期以来中药饮片国家标准严重缺乏等一系列问题，无疑将中药饮片的质量控制提高到一个新台阶，但大多数饮片标准还是采用药材标准的指标、方法和限度进行鉴别和含量测定。因此，确定对照饮片及其指纹图谱对鉴别饮片的质量十分必要。蒲黄炭的标准仅有性状、简单的显微鉴别和浸出物测定，不能有效控制蒲黄炭的质量。由于蒲黄生熟异治，因此，建立蒲黄炭有别于药材的质量控制方法具有重要意义。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的质量控制方法，已成为评价中药质量稳定性的重要手段。文献中［8-10］报道了蒲黄的HPLC指纹图谱，丁安伟等［11］对蒲黄及炒蒲黄的指纹图谱研究表明蒲黄炮制前后主成分色谱峰有显著区别。近年，通过HPLC-DAD指纹图谱发现蒲黄炭与生品的黄酮类色谱峰在含有量上有较大变化外，炒炭后有极性较大的新色谱峰生成，而且此部分还具有止血作用［12］。而应用HPLC特征指纹图谱鉴别蒲黄炭未见报道。本实验采用一种快速、简单的方法，建立10批不同地区蒲黄及蒲黄炭的指纹图谱，为蒲黄炭对照指纹图谱的建立及质量标准制定提供依据。

1 仪器、试剂与材料

1.1 仪器 DT-100型分析天平 (北京光学仪器厂);Simadzu高效液相色谱仪 (LC-10Atvp泵，DAD检测器，Class-vp工作站;日本岛津公司);C3860A型超声清洗器 (天津开发区色谱分析仪器有限公司);微量进样器 (美国HAMILTON公司)。

1.2 试剂 乙腈 (色谱醇，天津市康科德科技有限公司);娃哈哈饮用纯净水 (杭州娃哈哈集团有限公司);其它试剂均为分析纯。

1.3 试药 香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、槲皮素、柚皮素、山柰酚和异鼠李素对照品(自制，纯度﹥95%)，蒲黄药材10批 (见表1)，由沈阳药科大学刘晓秋教授鉴定为香蒲科香蒲属植物的花粉。

表1 蒲黄药材来源Tab.1 Sources of samples of Typhae Pollen

2 方法与结果

2.1 供试溶液的制备

2.1.1 蒲黄炭品的制备 取本品约100 g，按照《中国药典》2010年版 (一部)附录ⅡD炒炭法进行炮制，武火炒至样品表面为棕黄色，即得蒲黄炭品 (炒炭后减重约8%)。

2.1.2 生、炭供试品溶液的制备 分别取生品、炭品粉末约0.4 g，精密称定，精密加入甲醇20 mL，称定质量，加热回流提取1 h，放冷，再称定质量，加甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.1.3 混合对照品溶液的制备 精密称取香蒲新苷、异鼠李素-3-O-新橙皮糖苷、槲皮素、柚皮素、山柰酚及异鼠李素对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为 36.2、71.5、16.1、20.4、6.4、9.3 μg/mL 的混合对照品溶液。

2.2 色谱条件 Agilent TC-C18色谱柱 (5μm，250×4.6 mm，美国安捷伦科技公司);流动相为乙腈 (A)－0.05%磷酸溶液 (B)，梯度洗脱，0～15 min(95%-85%B)，15～20 min(85%-83%B)，20～35 min(83% ～80%B)，35～45 min(80% ～76%B)，45～50 min(76% ～60%B)，50～65 min(60% ～60%B)，65～70 min(60% ～95%B);体积流量0.8 mL/min;检测波长254 nm;进样量20μL。

2.3 炮制工艺重复性考察 分别精密称取蒲黄生品5份 (B3)，按2.1.1项平行制备蒲黄炭品，按2.1.2项平行制备蒲黄炭供试品溶液，分别进样并记录，测得各共有峰的相对保留时间RSD为0.4%～1.1%，相对峰面积的RSD为0.7%～4.5%，表明炮制工艺较稳定。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 精密吸取供试品溶液 (B3)，连续进样5次，以9号峰为内参比峰，测得各共有峰的相对保留时间RSD为0.1%～0.4%，相对峰面积的RSD为1.1%～2.8%，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱要求。

2.4.2 重复性试验 分别精密称取样品5份(B3)，按2.1.2项平行制备供试品溶液，分别进样并记录。测得各共有峰的相对保留时间RSD为0.1%～0.4%，相对峰面积的RSD为0.7%～2.8%。符合指纹图谱要求。

2.4.3 稳定性试验 取供试品溶液 (B3)，分别于制备后0、4、8、16、24 h进样分析，测得各共有峰的相对保留时间RSD为0.2%～1.5%，相对峰面积的RSD为1.1%～2.8%，表明供试液在24 h内稳定。

2.5 指纹图谱的分析与评价

2.5.1 指纹图谱的建立及部分色谱峰的指认 根据2.2项下色谱条件，分别对10批不同地区的蒲黄药材及蒲黄炭品进行了测定，采用“中药指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件，分别对生品和炭品进行色谱峰匹配，见图1;分别生成蒲黄生品、炭品共有模式的对照指纹图谱，见图2。

对照品混合溶液20μL，按2.2项下色谱条件测定，见图3。通过比较各色谱峰的保留时间，确定指纹图谱中香蒲新苷 (9号峰)、异鼠李素3-O-新橙皮糖苷 (11号峰)、槲皮素 (15号峰)、柚皮素 (16号峰)，山柰酚 (17号峰)、异鼠李素 (18号峰)的位置。其中9号峰与其他峰分离效果好，在色谱图中保留时间居中，故作为参比峰。

图1 10批蒲黄 (A)和蒲黄炭 (B)指纹图谱Fig.1 The finger p rints of Tyhae Pollen(A)and Typhae Pollen Carbonisata(B)from 10 batches

图2 蒲黄 (C)和蒲黄炭 (D)对照指纹图谱Fig.2 The reference fingerprints of Tyhae Pollen(C)and Typhae Pollen Carbonisata(D)

图3 对照品的HPLC图谱Fig.3 HPLC chromatograms of reference substances

2.5.2 生、炭品指纹图谱相似度分析及色谱峰变化情况 以共有模式为参照，通过国家药典委员会《中药指纹图谱相似度评价系统2004A版》计算，得到各批次药材色谱指纹图谱相似度结果见表2。生品、炭品对照指纹图谱保留时间、峰面积及变化率见表3。

由表2可以看出，蒲黄生品相似度除9号样品为0.865，其余在0.938～0.989。蒲黄炭品相似度在0.820～0.919之间，表明蒲黄生品的相似度比蒲黄炭品的相似度高，推测蒲黄炒炭后各类成分含有量变化可能与不同产地和品种有关。

通过表3并结合图2和图3表明，生蒲黄共有峰为15个，炭品18个。通过对蒲黄生、炭品的峰面积进行比较，炒炭后，保留时间在20 min前，有3个新增色谱峰，见图2(a)(峰1～3);保留时间在20～30 min时，色谱峰面积略有增加，见图2(b)(峰4～5);保留时间在30～50 min时，除14号峰外，黄酮苷所在部位色谱峰面积均呈明显下降势，见图2(c)(峰6～13);保留时间在50～70 min时，柚皮素及山柰酚略有下降，槲皮素和异鼠李素有所增加，见图2(d)。这充分说明了蒲黄经炒炭后，其化学成分发生了质和量的变化。

表2 蒲黄和蒲黄炭相似度比较Tab.2 Com parison of sim ilarities of Typhae Pollen and Typhae Pollen Carbonisata

表3 蒲黄和蒲黄炭峰面积及变化率Tab.3 The peak area and change rate of Typhae Pollen and Typhae Pollen Carbom isata(n=10)

2.6 指纹图谱鉴别蒲黄炭的质量 炒炭的温度和火候对蒲黄炭的质量至关重要，蒲黄炒炭过火，其原有成分几乎消失殆尽，而新增成分的量也会明显减少，见图4。因此可用指纹图谱鉴别蒲黄炭的质量。

图4 炒过火的蒲黄炭HPLC图谱Fig.4 HPLC chromatograms of Typhae Pollen Carbonisata fried excessively

3 讨论

3.1 应用HPLC-DAD检测，通过对各成分紫外吸收图谱的分析，综合考虑基线、色谱峰的数目、峰形及信号响应强度，确定254 nm为最佳检测波长。

3.2 本研究选取10批不同产地的蒲黄药材，根据《中国药典》2010年版 (一部)蒲黄质量进行检定，均为合格品。蒲黄炭品与蒲黄生品比较，各类成分含有量波动稍大，但相似度均大于0.8，这可能与药材的来源、品质及炮制过程中各类成分之间的相互作用有关。炒炭炮制的火候的掌握也非常重要，提示应注意炮制规范，有关蒲黄炮制机理及蒲黄炮制火候与外观颜色及质量的关系目前本研究组正在研究。

3.3 本实验建立的蒲黄炭的特征指纹图谱实际上隐含着其药效的指标，各种类别成分的色谱峰面积(峰高)的比值与药效的相关性是保证炮制品质量的重要参数，需要进一步累计多批数据加以确定。本方法快速、简单易行，与以单一化学对照品作为指标性成分的方法相比，能够较全面地反映蒲黄炭的质量。

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