一株柑橘木虱虫生真菌的分离与鉴定

鹿连明，杜丹超，胡秀荣，蒲占湑，张小亚，陈国庆

(浙江省柑桔研究所，浙江台州 318026)

柑橘木虱 (Diaphorina citri)属同翅目木虱科，是柑橘、柠檬、黄皮、九里香、枸杞等芸香科植物新梢期的主要害虫，也是传播柑橘黄龙病的唯一自然虫媒。柑橘黄龙病作为当前柑橘生产上防治最难、威胁最大的一种毁灭性病害，对柑橘产业的稳定和发展带来了严重威胁。但目前对该病害尚未获得有效的防治药剂，以防治柑橘木虱为主的综合防治是当前该病害防控的主要办法。因此，加强对柑橘木虱的防治，无论对于控制柑橘黄龙病的流行还是降低虫体本身对柑橘的危害都具有重要意义。

目前对柑橘木虱的防治多采用化学防治措施，由此造成了农药残留、环境污染、生物多样性破坏和柑橘木虱抗药性等诸多问题，而生物农药以其高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性和原料易得等特性被认为是未来化学农药的理想替代药剂。国内外研究者在利用植物提取物、昆虫天敌和生防菌等防治柑橘木虱方面进行了诸多有益的尝试［1］，但研究多处于实验室阶段，在农业生产中利用生防菌制剂成功防治的实例尚未见报道。因此，柑橘木虱虫生真菌的进一步分离筛选和生物潜能的研究，对于促进将来柑橘木虱生物防治的顺利开展具有重要的意义。本研究通过采集柑橘木虱虫体，并从中分离出病原菌，以期筛选出对柑橘木虱具有较强致病力的菌株，以丰富现有的柑橘木虱虫生真菌资源，为将来柑橘木虱生防菌的开发利用提供材料。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

分离病原菌所用的柑橘木虱虫体采集于浙江省台州市黄岩区不同柑橘园内;测定病原菌的致病性所用的健康柑橘木虱成虫为浙江省柑橘研究所温室中九里香植株上常年继代饲养的种群。

1.2 试剂和培养基

dNTP、r－Taq酶等 PCR相关试剂，TaKaRa公司;CTAB、巯基乙醇、异丙醇，Amersco公司;核酸染料GelRed，Biotium公司;凝胶回收试剂盒，Axygen公司。其余试剂为国产分析纯。

用于病原真菌分离培养所用的培养基为马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA)培养基。称取200 g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1 000 mL煮沸0.5 h，纱布过滤，再加20 g葡萄糖和20 g琼脂，充分溶解后用热纱布过滤，分装至锥形瓶或玻璃试管中，121℃，高压灭菌20 min。

1.3 引物

所用引物为扩增真菌ITS区域的通用引物ITS5(5'－GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG－3') 和 ITS4(5'－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3')，由上海 Invitrogen公司合成。

1.4 病菌的分离纯化

将田间采集的柑橘木虱置于无菌离心管中带回实验室，对虫体表面已有肉眼可见菌丝体的柑橘木虱虫尸，直接放于PDA培养基中;对柑橘木虱活虫或表面无菌丝的虫尸，先置于70%乙醇中浸泡30 s，再经0.1%升汞浸泡3 min后，用无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干虫体上的水分，再置于PDA培养基中。随后将各载有虫体的培养基置于28℃微生物培养箱中恒温培养，至虫体周围长出菌丝后，挑取菌丝转至新的PDA平板上培养 (重复此操作2～3次)，待菌落上产生分生孢子，用无菌水洗脱分生孢子制备成分生孢子悬浮液，然后用稀释纯化法对病菌进行单孢分离。最后将分离纯化获得的菌株保存于PDA斜面培养基中，培养3～4 d后，置于4℃冰箱保存。

1.5 致病菌的筛选

将上述分离纯化保存的菌株接种到PDA平板上，于28℃恒温培养10 d后，以无菌水洗脱菌落上产生的分生孢子，制备分生孢子悬浮液。以血球计数板确定孢子悬浮液的浓度，并向其中加入适量的吐温80至终浓度为0.1%。取温室饲养的健康柑橘木虱成虫浸没于含0.1%吐温80的分生孢子悬浮液中10～15 s，挑取处理后仍能自由活动的柑橘木虱置于培养皿中的九里香叶片上 (培养皿底部铺有2层用无菌水湿润过的滤纸，其上放置一个带有10个左右叶片的九里香嫩枝，枝条底端以无菌水湿润的脱脂棉包裹)，然后放于28℃光照培养箱中 (每天14 h光照/10 h黑暗，湿度95%以上)培养。上述每处理重复3次，每个重复为30头柑橘木虱;同时设含0.1%吐温80的无菌水处理柑橘木虱为对照。于体视显微镜下观察病菌对柑橘木虱的侵染和致死情况，记录上述各处理的柑橘木虱的总虫数和死亡虫数，计算死亡率和校正死亡率。

通过上述方法，从处理后的柑橘木虱虫体中分离病菌，比较再分离的病菌与初始接种病菌的形态特征和培养特征，筛选出符合科赫氏法则的对柑橘木虱具致病性的菌株，排除从柑橘木虱虫体上分离到的腐生菌等非致病菌。

1.6 菌株GJMS032培养特征和形态特征

将上述分离纯化的菌株GJMS032接种到PDA培养基平板中央，置于28℃恒温培养，每日观察菌落生长情况，并记录菌落颜色和形态。将菌株GJMS032接种到另一PDA培养基平板中央，同时将灭菌后的盖玻片 (1 cm×1 cm)斜插入距接种点约1 cm处的培养基内，置于28℃恒温培养约5 d，待菌丝爬到盖玻片上后，取出盖玻片置于光学显微镜下观察菌株GJMS032的菌丝和孢子形态。

1.7 菌株GJMS032的序列分析

1.7.1 总DNA的提取

将菌株GJMS032接种至PDA培养基平板，置于28℃恒温培养至菌落长满整个培养皿，以无菌药匙刮取平板上生长的真菌菌丝于无菌研钵中，加入液氮研磨至粉末状，采用改良的CTAB法提取菌株GJMS032的总DNA。具体方法为:加入1 mL预热的2%的CTAB缓冲液及10～20 μL β－巯基乙醇，转移到1.5 mL离心管中，于65℃水浴30～60 min;加入酚/氯仿/异戊醇 (25∶24∶1)抽提1～2次;再用氯仿/异戊醇 (24∶1)抽提1次;取上清，加入预冷的异丙醇，－20℃放置30～60 min以沉淀DNA;适量75%乙醇洗涤沉淀2次;沉淀于室温下自然晾干，然后于10～20 μL TE(含RNase 50 mg·L－1)中溶解，所得溶液即为样品DNA溶液。取1 μL溶液上样于0.8%的琼脂糖凝胶上进行电泳，检测所提取的DNA质量。

1.7.2 PCR扩增

以提取纯化的DNA为模板，以通用引物ITS5和ITS4 扩增菌株 GJMS032 的 ITS1－5.8S rDNA－ITS2基因。PCR反应体系为:10×Buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，上下游引物 (10 μmol·L－1)各 1.5 μL，r－TaqDNA聚合酶0.2 μL，DNA模板1 μL，无菌水补足至总体积25 μL。反应条件为94℃ 5 min，94℃1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环，72℃10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳观察拍照。

1.7.3 测序及序列分析

于琼脂糖凝胶上割取PCR产物的目的条带，利用Axygen胶回收试剂盒回收纯化，然后送交至Invitrogen公司利用引物ITS5/ITS4进行两端测序。利用NCBI Blast对所测序列进行比对分析，查看其与GenBank中已知物种对应序列的相似性。选取GenBank中与之同源性较高的一些菌种的序列，利用Clustal X进行多重比对后，使用MEGA 5.05软件，通过Neighbor joining方法构建系统发育树，在构建系统发育树时进行自举检验，重复抽样1 000次。

2 结果与分析

2.1 菌株GJMS032的致病性

通过筛选获得1株对柑橘木虱具有致病力的菌株，命名为 GJMS032。以1.0×109spores·mL－1菌株分生孢子悬浮液处理柑橘木虱后3 d，校正死亡率为38.5%;处理后7 d，校正死亡率达98%。处理后第2天，通过体视显微镜，即可在一些虫体表面观察到菌丝长出，至7 d后，肉眼可见菌株GJMS032的产孢结构 (图1)。

图1 菌株GJMS032对柑橘木虱的侵染

2.2 菌株GJMS032的培养特征和形态特征

菌株GJMS032在PDA培养基上于25℃恒温培养7 d，其菌落直径可达5 cm，具同心环纹。菌丝体为白色，分生孢子呈赭黄色，质地丝绒状，具少量无色渗出液，菌落反面为黄褐色。

光学显微镜下观察菌株的分生孢子头呈球形，分生孢子梗直立，孢梗茎长650～1 600 μm，宽10～15 μm，茎壁粗糙，顶囊球形或近球形，直径25～45 μm，产孢结构双层，梗基大小为5～7 μm×2.5～4 μm，瓶梗大小为8 ～12 μm ×3 ～4 μm;分生孢子为球形或近球形，直径2.5～3.5 μm(图2)。

图2 菌株GJMS032在光学显微镜下的形态特征

2.3 菌株GJMS032的序列分析

经琼脂糖凝胶电泳检测，通用引物ITS5/ITS4扩增菌株GJMS032的PCR产物大小为610 bp左右。测序后选取其中的ITS1－5.8S rDNA－ITS2基因区域，利用NCBI Blast进行在线比对。分析发现，所测序列与GenBank中Aspergillus westerdijkiae和A．ochraceus多个分离物的序列相似性达98% ～100%。

在系统发育树中 (图3)，菌株GJMS032与A．westerdijkiae，包括模式菌株 NRRL3174(GenBank NO.EF661427)在内的多个分离物及A．ochraceus的几个分离物聚为1个分支，而A．ochraceus的模式菌株 (GenBank No.AY373856)及其他几个分离物和曲霉属其他几个种的菌株聚为另外1个分支。基于上述关于形态特征和培养特征的描述及对ITS1－5.8S rDNA－ITS2 序列的 分析，可 将 菌 株GJMS032初步鉴定为A．westerdijkiae。

图3 基于ITS1－5.8S rDNA－ITS2基因构建的菌株GJMS032系统发育树

3 小结与讨论

目前已报道的对柑橘木虱具有致病作用的真菌有拟青霉属的宛氏拟青霉 (Paecilomyces varioti)和玫烟色拟青霉 (P．fumosoroseus)、白僵菌属的球孢白僵菌 (Beauveria bassiana)、绿僵菌属的金龟子绿僵菌 (Metarhizium anisopliae)、被毛孢属的檬形被毛孢 (Hirsutella citriformis)、笋顶孢属的蚜笋顶孢霉 (Acrostalagmus aphidium)、镰孢属的黄色镰刀菌 (Fusarium culmorum)、轮枝孢属的蜡蚧轮枝菌 (Lecanicillium lecanii)、枝孢属的尖孢枝孢菌(Cladosporiumoxysporum)及柑橘煤炱菌(Capnodium citri)、匍柄霉 (Stemphyliumsp.)等［2－3］。对于曲霉属真菌侵染柑橘木虱的研究报道较少。上世纪80年代，陈祝安等［2］从田间发病的柑橘木虱虫体上分离到了日本曲霉 (A．japonica)，但未对其致病性进行验证。

根据培养特征、形态特征及ITS1－5.8S rDNAITS2序列，可将所分离的菌株GJMS032鉴定为曲霉属的一种真菌。但其ITS1－5.8S rDNA－ITS2序列与 GenBank中曲霉属的A．westerdijkiae和A．ochraceus的多个分离物均具有较高的同源性，难以鉴定其具体为哪一个种。通过查阅文献发现，A．westerdijkiae是近年来从A．ochraceus新分离出来的一个种，原来A．ochraceus的一些分离物现已被重新鉴定为A．westerdijkiae。2个菌种的形态特征具有高度的相似性，但可通过 ITS1－5.8S rDNA－ITS2和 β－tubulin 基因序列区分开来［4－8］。在系统发育树上，菌株GJMS032与A．westerdijkiae的模式种聚为一个分支，其中也含有多个A．ochraceus的分离物，推测认为这些A．ochraceus分离物可能未得到重新鉴定更新而沿用了以前的名称，实际可能是A．westerdijkiae。而A．ochraceus的模式种和其他多个分离物处于另外一个分支中。基于以上分析，将菌株初步鉴定为A．westerdijkiae。

曲霉属真菌种类繁多，在世界范围内广泛分布。其中作为虫生真菌报道过的种类有A．flavus、A．parasiticus、A．oryzae、A．tamarii、A．ochraceus、A．niger和A．candidus等［9］。如 Kodaira 等［10］从A．ochraceus侵染的家蚕幼虫的血液中提取的物质注入健康家蚕的体腔中能致死家蚕，从而表明毒素的存在;Robert等［11］研究发现，A．ochraceus在昆虫体内可产生赭曲霉素，通过体腔注射美国白蛾可使其麻痹死亡。Vega等［12］发现，A．westerdijkiae可侵染咖啡果小蠹的寄生蜂Prorops nasuta，并可产生赭曲霉素A。本研究所分离的菌株GJMS032，初步鉴定为A．westerdijkiae，对柑橘木虱具有较强的致病作用。遗憾的是，曲霉属真菌通常会产生多种对人和动物有害的毒素，如赭曲霉毒素通常对肾有危害及对免疫系统有毒性［13］，因此难以在植物病虫害的生物防治中推广应用。

［1］杜丹超，鹿连明，张利平，等.柑橘木虱的防治技术研究进展 ［J］.中国农学通报，2011，27(25):178－181.

［2］陈祝安，曹光照，许益伟，等.柑桔害虫病原真菌资源的考察和生测［J］.微生物学通报，1985，12(5):194－198.

［3］Meyer JM，HoyM A，BouciasD G. Isolation and characterization of anIsaria fumosoroseaisolate infecting the Asian citrus psyllid in Florida ［J］.Journal of Invertebrate Pathology，2008，99(1):96－102.

［4］Frisvad J C，Frank J M，Houbraken J A M P，et al.New ochratoxin A producing species ofAspergillussectionCircumdati［J］.Studies in Mycology，2004，50(1):23－43.

［5］Gil－Serna J，Vázquez C，Sardiñas N，et al.Discrimination of the main Ochratoxin A－producing species inAspergillussectionCircumdatiby specific PCR assays ［J］.International Journal of Food Microbiology，2009，136(1):83－87.

［6］Noonim P，MahakarnchanakulW，NielsenK F，etal.Isolation，identification and toxigenic potential of ochratoxin A－producingAspergillusspecies from coffee beans grown in two regions ofThailand ［J］. InternationalJournalofFood Microbiology，2008，128(2):197 －202.

［7］Gil－Serna J，González－Salgado A，González－Jaén M T，et al.ITS－based detection and quantification ofAspergillus ochraceusandAspergillus westerdijkiaein grapes and green coffee beans by real－time quantitative PCR ［J］.International Journal of Food Microbiology，2009，131(2/3):162－167.

［8］Morello L G，Sartori D，de Oliveira Martinez A L，et al.Detection and quantification ofAspergillus westerdijkiaein coffee beans based on selective amplification of β－tubulin gene by using real－time PCR ［J］. International Journal of Food Microbiology，2007，119(3):270 －276.

［9］蒲蛰龙，李增智.昆虫真菌学［M］.合肥:安徽科学技术出版社，1997.

［10］Kodaira Y.Toxic substances to insects produced byAspergillus ochraceusandOospora destructor．Agricultural and Biological Chemistry，1961，25:261－266.

［11］Roberts D W.Toxins of entomopathogenic fungi.In:microbial control of pests and plant diseases［M］.New York:Academic Press，1981.

［12］Vega F E， Posada F， Gianfagna T J， et al.An insect parasitoid carryingan ochratoxin producingfungus［J］.Naturwissenschaften，2006，93(6):297－299.

［13］黄天培，何佩茹，潘洁茹，等.食品常见真菌毒素的危害及其防止措施［J］.生物安全学报，2011，20(2):108－112.