大肠埃希菌对氟喹诺酮类药物耐药机制的研究

杨其

氟喹诺酮类药物是一类广谱、强效的化学合成药物，临床上已广泛用于各种细菌性感染。但是随着这类药物在临床的大量应用，其耐药菌株呈蔓延趋势，严重影响了其临床疗效及应用。已知细菌对氟喹诺酮类药物的主要耐药机制为:(1)靶位基因Ⅱ型拓扑异构酶即DNA回旋酶基因 (gyrA和gyrB)和拓扑异构酶Ⅵ基因 (parC和parE)突变;(2)细菌膜通透性的降低和膜上药物主动外排泵的激活;(3)质粒qnr基因介导细菌对氟喹诺酮类耐药。大肠埃希菌的耐药机制不断发展，造成日益严重的耐药问题，已成为重要的医院感染病原体之一［1］。现就大肠埃希菌对氟喹诺酮类药物耐药机制的研究进展作一综述。

1 药物作用靶位的改变

抗生素的杀菌、抑菌作用是与细菌不同部位上的靶位蛋白结合，抑制其功能而生效。而细菌的耐药则可以通过不同方式改变靶位蛋白结构，使抗菌药与其结合力下降或不能结合。DNA回旋酶和拓扑异构酶Ⅳ是喹诺酮类药物的主要作用靶位。

1.1 DNA回旋酶 DNA回旋酶是由2个A亚基和2个B亚基构成的四聚体，分别由gyrA和gyrB基因编码。早在20世纪80年代通过比较敏感菌和自发耐药菌、人工诱变耐药菌的染色体，已经发现了编码旋转酶的基因突变。gyrA和gyrB基因的突变只限于编码1个氨基酸的3个碱基中的1个发生替换。gyrA的突变主要有4个位点，而且集中在较小的区域，将这一基因区段称为氟喹诺酮耐药决定区 (quinolones resistance determining region，QRDR)，即第199～318个碱基 (Ala67－Gln106)。已证实QRDR的突变与细菌耐药有直接关系［2－3］。只有氨基酸发生取代的碱基突变才可改变细菌对药物的敏感性。近年来研究发现gyrA的QRDR内氨基酸取代方式、位置、取代位点的多少与E.coli耐药水平有着密切的关系。尤其是gyrA基因改变最常见，其次是gyrB。gyrB基因突变较为单一，目前发现氨基酸的替换只有两个比较集中的位点，即第426和447位，都为单个氨基酸替换。gyrB突变促进gyrA突变耐药性的产生，目前尚无资料表明gyrB突变作为独立的耐喹诺酮类的机制。Dela Fuente等［4］研究证实Ser83是gyrA的基本突变点，gyrA基因中密码子83发生突变常常造成大肠埃希菌对喹诺酮类抗菌药物耐药。同时报道一株大肠埃希菌发生双重突变，在密码子83 Ser to Leu，以及在密码子87 Asp to Asn。国内也有相关报道gyrA基因突变，除常见氨基酸改变外，还发现密码子 87 Asp to Asn、密码子 84 Ala to Pro［5］。

1.2 拓扑异构酶Ⅳ 拓扑异构酶Ⅳ是由2个C基因和2个E基因组成的四聚体，分别由parC和parE基因编码。拓扑异构酶ⅣA亚单位和DNA回旋酶A亚单位在NH2－末端有很高的同源性，即gyrA和parC的N末端均有与喹诺酮耐药决定区域QRDR有关的区域，在此区发生氨基酸的替代影响了喹诺酮类药物与酶结合的紧密关系，从而使其耐药性增加。拓扑异构酶Ⅳ只是药物的从属靶位，DNA回旋酶对氟喹诺酮类药物比拓扑异构酶Ⅳ更敏感［6］。蒋萍等［5］通过聚合酶链反应 (PCR)扩增大肠埃希菌耐药株的gyrA QRDR区和parC基因，进行PCR SSCP分析;同时，PCR扩增marOR基因，在耐药株中随机选取进行测序，检测marOR基因突变情况。发现gyrA和parC基因突变引起大肠埃希菌产生耐药，Chenia等［6］报道ParC突变发生在Ser－80/Glu－84，gyrA基因突变是产生对氟喹诺酮类耐药的主要原因，parC基因突变可引起菌株对氟喹诺酮类药物的高水平耐药。

2 膜通透性屏障及相关基因突变

大肠埃希菌增加抗生素渗透障碍的主要方式是改变跨膜通道孔蛋白结构性质，使其与抗生素结合力下降，以及减少跨膜通道孔蛋白数量甚至使之消失，从而减少药物在细胞内的积聚。大肠埃希菌外膜上存在多种外膜蛋白 (Omp)，主要有OmpA、OmpF、OmpC和OmpK。其中OmpF和 OmpC为大肠杆菌的主要Omp。OmpF和OmpC在大肠杆菌中的表达以协调方式紧密相关，以保持Omp总量的恒定。当细菌染色体的基因突变引起膜通透性降低影响药物的转运时，细菌即可发生耐药。在耐氟喹诺酮大肠埃希菌的染色体上已发现norB、norC、nfxc、nfxB和cfxB等多个染色体突变基因，携带这些突变基因的耐药株几乎都具有相同的表型Omp的异常，尤其是作为亲水性小分子药物通道的OmpF的减少或缺失，使细菌对氟喹诺酮类药物的摄入减少。OmpC通道缺失的菌株对氟喹诺酮类药物的敏感性似乎不变，提示OmpF减少或缺失是细菌膜通透性降低的主要因素［7］。OmpF的表达是通过micF基因调控的，它编码一小段反义RNA，与OmpF的mRNA5末端互补，从而阻止OmpF的翻译过程，最终导致OmpF的蛋白合成量降低［8］。但是Hirai等［9］对大肠埃希菌norC突变株的研究表明，仅由膜通透性降低所引起的药物蓄积浓度减少极其有限，这提示除OmpF异常外，一定还存在其他引起药物蓄积浓度降低的决定因素。Chenia等［6］同时还发现具有粗糙LPS的大肠埃希菌内环丙沙星蓄积量高于具有光滑LPS的菌株，并且与OmpF的表达无关。

3 主动外排活跃

主动外排系统是指细菌细胞内膜存在能量依赖性蛋白外排泵，通过主动外排作用将药物从菌体排出，使达到作用靶位的药量明显减少，不足以发挥杀菌或抑菌作用。目前发现与氟喹诺酮类药物耐药性有关的主动外排系统均为多重药物外排泵。多重药物外排泵根据其转运蛋白的作用方式及消耗能量的来源不同分为两类［10－11］:一类是以质子驱动力为能量，以“H药物”方式向细胞外作反向转运;另一类为ABC，以ATP驱动力为能量，由ATP结合盒向胞外转运。大肠埃希菌以前者为主，前者按转运蛋白的分子结构、同源性及作用方式又可分为4类:(1)MF(major faciliator family);(2)RND(resistance－nodulation－division family);(3)SMR(small multidrug resistance); (4)MATE(multidrugand toxic compound extrusion)。研究表明，大肠埃希菌与氟喹诺酮类药物耐药性有关的主动外排泵有3个:AcrAB、MdfA和NorE。其中AcrABTolC系统为主要代表，是目前耐药研究中的热点，属于质子依赖型，能够产生对多种抗菌药的高水平的多重耐药。AcrAB－TolC系统主要由细胞内膜泵 (AcrB)通过跨膜融合蛋白(AcrA)与外膜的排除泵 (TolC)连接而组成，它有一个宽的底物范围，主要包括:喹诺酮类、氯霉素、红霉素、四环素、青霉素、利福平等多种抗生素，染料和去污剂等。通常情况下AcrAB－TolC系统处于低水平表达，但在选择性压力下会去阻遏出现高表达。目前研究发现，药物分子外排主要和H相偶联［12］，它们构成一个反向转运蛋白，通道开放后，H由于浓度梯度内流，药物分子随即外排。AcrAB由AcrAB操纵子编码，而编码外膜蛋白TolC的基因TolC则位于染色体的其他区域。AcrAB的表达受多种调控因子的调节，MarA、RobA、SoxS是AerAB的正调控蛋白，可同时增加AcrAB和TolC的表达。Jellen－Ritter等［13］研究表明AcrR是位于AcrAB基因上游的阻遏蛋白基因，可通过直接增加AcrR数量阻止AcrAB超表达，AcrR突变去阻遏，也可使AcrAB表达增加。同时发现AcrAB缺失突变体也表现出对氟喹诺酮类药物耐药性和多重药物耐药表型。另外，MppA对AcrB的转录起负调节作用，MppA的无意义突变株中外膜蛋白OmpF的表达也减少了，可与外排泵产生协同耐药。方治平等［14］实验观察主动外排泵激活剂 (葡萄糖)和抑制剂 (氰氯苯腙)对氟喹诺酮类药物在菌体内蓄积量的影响，证明主动外排泵对相对亲水性氟喹诺酮类药物的泵出功能明显强于其对疏水性氟喹诺酮类药物的作用。

4 质粒介导的耐药机制

1998年第1个喹诺酮类耐药质粒 (pMG252)在美国阿拉巴马州的1株临床分离的肺炎克雷伯菌中发现，该质粒可将喹诺酮耐药性转移至大肠埃希菌、β－内酰胺类、氨基糖苷类、氯霉素、磺胺类抗菌药物均耐药［15］。后来在该质粒内发现了喹诺酮耐药基因qnr，它位于整合子样结构 (与整合子In6和In7同源)qacE△1(季铵盐化合物及溴乙锭的耐受基因)和sull(磺胺耐药基因)的上游，并被orf 513围绕。qnr编码的蛋白qnr属于五肽重复家族，与免疫球蛋白McbG有序列同源性，后者通过抑制合成MccB17来保护DNA解旋酶。qnr具有前后各11个和28个拷贝的五肽重复结构域，被单一的甘氨酸通过一致的序列A/CD/NI/FxX(其中x为任意氨基酸)隔开。Tran等［16］研究还发现:在酶催化反应的早期，也就是促旋酶刚开始与DNA相互作用时，qnr就可能特异地结合到促旋酶及其相应的亚基GyrA和GyrB上，但qnr并不与喹诺酮药物竞争结合促旋酶的结合位点;qnr与促旋酶的相互作用影响了促旋酶的内在活性，降低了促旋酶与DNA的结合，这就意味着喹诺酮作用的全酶－DNA靶位的数量减少;qnr与促旋酶的结合，改变了药物结合区域的构象，从而降低了药物识别靶位的效率。Rodríguez－ Martínez等［17］研究证明表达 qnra1 基因的菌株，gyrA和parC基因容易发生突变，以产生高水平的喹诺酮耐药性。另外qnr也可能干扰喹诺酮与促旋酶的结合导致终末复合体DNA酶药物的形成减少或qnr可能并不直接影响喹诺酮与促旋酶的结合，而仅使终末复合体的稳定性降低，从而不能有效地阻止复制的进行和DNA的复制而耐药。大肠埃希菌的第二靶位拓扑异构酶Ⅳ似乎也受qnr蛋白的保护。进一步的研究发现qnr质粒很大，为10～50 kbp，同时携带多种抗菌药物耐药决定簇［18］。迄今为止已鉴定的耐药决定簇包括:(1)aac基因:编码乙酰转移酶，介导对氨基糖苷类药物耐药。(2)bla基因:编码FOX－5、DHA－1、OxA－30和SHV－7型内酰胺酶，介导对β－内酰胺类耐药。(3)cat基因:编码氯霉素乙酰转移酶，介导对氯霉素耐药。(4)qaeEA1基因:编码外排泵，排出季铵盐化合物。(5)sull基因:编码二氢叶酸合成酶，介导对磺胺类耐药。多种抗菌药物耐药决定簇共存于一种可转移的质粒上，预示着任一种抗菌药物耐药的发生都可能导致伴随的其他抗菌药物耐药基因的表达。其中aac基因:编码乙酰转移酶，介导对氨基糖苷类药物耐药。同时大量研究发现质粒介导和染色体介导的耐药间可能也存在着某种联系。Ambrozic Avgustin等［19］研究发现aac(6')Ibcr基因是低水平PMQR基因，推测它可以增强染色体突变的选择，并作为临床耐药水平的发生和传播的原因。qnr基因的单独存在可使菌株对喹诺酮药物的敏感性降低，但可能并未达到具有临床意义的喹诺酮耐药水平或仅仅导致低水平的喹诺酮耐药。但含qnr的菌株在喹诺酮药物的选择压力下容易发生染色体突变，或者含染色体突变的菌株在适宜的条件下可以捕获qnr基因，在这两种情况下菌株同时具有了质粒和染色体介导的喹诺酮耐药机制，引起高水平喹诺酮耐药。

综上所述，大肠埃希菌对氟喹诺酮类药物耐药机制:药物作用靶位的改变、膜通透性降低及主动外排活跃、质粒介导的耐药机制，可单独或协同作用，使细菌发生对氟喹诺酮类药物耐药，甚至多重耐药［20］。因此，我们应该合理使用抗感染药物，研究细菌耐药机制以及抗生素疗效评价，寻找和研制有抗菌活性的新抗菌药物，同时寻找有效的酶抑制剂。

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