基于石英晶体微天平传感的ELISA测定水体中残留氯霉素

周亚民 叶领云

(东莞理工学院 化学与环境工程学院，广东东莞 523808)

氯霉素(CAP)是一类广谱抗生素，常用于动物各种传染性疾病的治疗，对多种病原菌有较强的抑制作用，曾在水产养殖业中得到广泛应用，同时也带来了水产品中氯霉素残留的严重问题〔1－3〕。氯霉素对人的造血系统、消化系统具有严重的毒性反应，有可能引发人的再生障碍性贫血，还会引起视神经炎、皮疹等不良反应。在美国仅允许氯霉素应用于非食用性动物，规定在任何动物性食品中不得检出氯霉素。欧共体禁止氯霉素应用于产奶母牛和产蛋鸡，在其他动物性食品中的含量也做了限制。目前常用的检测氯霉素的方法有液相色谱法、放射免疫分析法、酶联免疫分析法〔4－11〕。高效液相色普法操做复杂，检测周期长，免疫分析法具有专业性好，灵敏度高等优点〔12－16〕。

压电传感器是一种对质量变化非常敏感的石英晶体微天平，厚度剪切压电石英晶体频移(ΔF)与晶体表面均匀吸附的极薄层物质质量(ΔM)存在正比例关系。基于酶催化底物反应生成沉淀使晶片谐振频率降低，石英晶体微天平可以用于酶的分析。压电免疫传感器技术一般是把抗体固定在压电石英晶体表面上，依据免疫反应引起的质量及界面粘弹性变化来进行分析。本文基于石英晶体微天平作转换器的ELISA 用于测量氯霉素的浓度。HRP－CAP 作标记物，抗CAP 抗体通过氨基硅烷化试剂和2－氨基乙硫醇层固定在石英晶片表面上，采用竞争酶联吸附免疫分析形式，以TMB 作酶的底物。结合在晶片上的酶标物催化底物氧化形成二聚体沉淀使石英晶体谐振频率降低，据此测量酶标物HRP－CAP 和待测物的CAP 量。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

CN3165 型高分辨计数器(石家庄无线电四厂)，石英晶体谐振器(北京七0 七厂):AT 切型，9 MHz 双面镀金电极，晶片直径12 mm，电极直径6 mm，谐振电路为自制TTL－IC 电路，CS501 型超级恒温器(重庆实验设备厂)，氯霉素、酶标氯霉素、氯霉素抗体购自深圳市博奥通科有限公司，γ－氨丙基三乙基硅烷，2－氨基乙硫醇，3，3，5，5－四甲基联苯胺，HRP 购自Sigma 公司。培育溶液为含1%BSA 的和1 mM EDTA 的0.1 M 的磷酸盐缓冲液，洗液为PH = 7.4 的0.1 M 的PBS 溶液 酶底物溶液为含0.5 mM TMB 和1 mM H2O2的pH 5.0 的磷酸盐缓冲液。不同浓度的CAP 和HRP－CAP 溶液用含有1%(w/w)的牛血清蛋白的0.1 M tris－HCl 缓冲溶液稀释标准CAP 和HRP－CAP 溶液而得。

1.2 CAP 抗体的固定方法

石英晶片依次用丙醇浸泡10 分钟，1∶1 的乙醇浓盐酸中浸泡30 分钟，浓硫酸中浸泡30 分钟，5 M氢氧化钠浸泡10 分钟，用蒸馏水漂洗后，干燥，浸入2%的3－氨基丙基三乙氧基硅烷化试剂的无水乙醇溶液中，20 分钟后用无水乙醇冲洗干净。在105℃环境下加热1 小时，得到富含NH2基的表面，然后在2－氨基乙硫醇溶液中自组装6 小时，用蒸馏水清洗晶片，然后用3%的戊二醛PBS 溶液活化三小时，洗去游离的戊二醛，将100 μL 体积的的CAP 抗体溶液涂覆在戊二醛活化过的晶片上，在冰箱中过夜，洗去游离的抗体后，用0.5 mg·mL－1的新配置的NaBH4溶液还原戊二醛与氨基形成的席夫碱以稳定蛋白质修饰层。最后晶片用PBS 清洗放入4℃冰箱中保存。

1.3 免疫分析过程

免疫分析采用竞争ELISA 方法，如图1 所示，晶片用100 μL 包含HRP－CAP 和CAP 的培育溶液培育，使待测的CAP 与HRP－CAP 竞争结合到固定在晶片上的抗CAP 抗体上。用洗液洗去游离的CAP 及HRP－CAP 后，将晶片放入pH = 5.0 的磷酸缓冲溶液中，并注入TMB 溶液，频率稳定后，记下频率值F1，加入H2O2，记录频率F2，在5 分钟内的频移变化值ΔF = F1－F2用来确定结合在晶片上HRPCAP 的量，从而间接测定溶液中CAP 的浓度。

图1 测定氯霉素竞争免疫分析法分析程序

1.4 传感器敏感面的再生方法

测试完成后，用50% 的二甲基亚砜水溶液溶解沉淀，然后用pH=2.3 的甘氨酸－盐酸缓冲溶液洗涤，解离晶体表面上免疫复合物，并洗去CAP 和HRP－CAP，从而使免疫传感器敏感面得到再生。

2 结果与讨论

2.1 抗体固定效果评价

对CAP 抗体固定效果进行评价，同样的条件，通过3－氨基丙基三乙氧基硅烷化试剂将抗体固定在石英晶体微天平表面制成免疫传感器，通过3－氨基丙基三乙氧基硅烷化试剂和2－氨基乙硫醇将抗体固定在石英晶体微天平表面制成免疫传感器。固定有抗CAP 抗体的石英晶片用0.5 μg·L－1的HRP－CAP 培育50 分钟，用PBS 溶液冲洗三次，洗去非特异性吸附的酶标物，浸入0.5 mM TMB 的PBS 溶液中，待晶片谐振频率稳定后，加入H2O2，并记录石英晶片的谐振频率。作为对比，未用酶标物培育的石英晶片在同样浓度的TMB 和H2O2溶液中，并监测石英晶体的谐振频率。如图2 所示，传感器经酶标物CAP 培育后，在TMB+ H2O2底物溶液中，晶片谐振频率不断降低，这是因为经过免疫反应，CAPHRP 结合在晶片上，它能催化TMB(1)与H2O2反应在晶片形成沉淀(2)。而未经CAP－HRP 培育的晶片在TMB + H2O2溶液中，晶片谐振频率基本保持不变。这说明在酶催化质量放大的石英晶体微天平传感器中，TMB 作为HRP 的底物能有效地检测HRP。通过3－氨基丙基三乙氧基硅烷化试剂将抗体固定在石英晶体微天平表面制成免疫传感器的频率响应值为57 Hz，同样条件下通过3－氨基丙基三乙氧基硅烷化试剂和2－氨基乙硫醇将抗体固定在石英晶体微天平表面制成免疫传感器频率响应值为82 Hz，说明通过有机硅烷试剂和2－氨基乙硫醇自组装可以在石英晶体微天平的金电极表面固定更多的CAP 抗体，免疫传感器有更大的响应。

图2 传感器频率响应与时间关系

2.2 培育溶液pH 值的影响

免疫分析过程中，溶液pH 值影响蛋白质荷电性，从而影响抗体对抗原结合力。在pH 为5.5 ～8.5的范围里考察了培育溶液pH 值对传感器响应的影响，如图3 所示，传感器在0.7 μg·mL－1HRP－CAP培养液里培育50 分钟，pH=7.0 ～7.5 的培育溶液最有利于免疫反应。在pH 高于7.5 或pH 低于6.5的溶液中培育，传感器的响应均较低。实验中选用pH =7.5 的磷酸盐缓冲溶液作为培育溶液用来分析CAP 的浓度。

2.3 HRP－CAP 用量的影响

传感器的响应大小与其表面上酶标物的量相关，培育液中酶标物的浓度影响结合到传感器表面上的酶标物的量。为了用较少量的酶标物去获得较大的响应，考察了培育溶液中酶标物浓度对传感器响应的影响。如图4 所示，传感器在不同浓度的HRP－CAP 培养液里培育50 分钟，培育溶液中酶标用量增加，传感器响应增大。基于传感器有较大的响应，并用较少的酶标物用量，一个包含0.4 μg·mL－1酶标物的培育液用来测定CAP。

图3 培育溶液pH 对传感器电流响应的影响

图4 培育溶液中HRP－CAP 浓度对传感器电流响应的影响

2.4 培育时间的影响

在传感器表面上，抗原抗体发生免疫反应形成免疫复合物需要一定时间。实验考察了培育时间对传感器响应的影响，传感器在含0.4 μg·mL－1HRP－CAP 和0.4 μg·mL－1CAP 的培育液中培育不同时间并测量频率响应，如图5 所示，传感器在0.7 μg·mL－1HRP－CAP 培养液里培育不同时间，传感器的响应随培育时间增加而增大，30 分钟达到平衡，因此在实验中取40 分钟作为培育时间。

图5 培育时间对传感器电流响应的影响

图6 传感器频率响应与氯霉素浓度对数值的关系

2.5 传感器的响应曲线及初步应用

在优化的实验条件测定了传感器的工作曲线，如图6 所示，培育液中CAP 浓度高，复合到传感器表面的HRP－CAP 量的就少，结果传感器频率变化值也少。在0.3 ～180 μg·L－1CAP 范围内，传感器的响应与CAP 浓度的对数有近似的线形关系。

2.6 测定的选择性

研究了环境样品中存在60 μg·L－1的CAP 时，常见干扰物质氯霉素碱、四环素、甲基氯霉素、庆大霉素、青霉素、红霉素、强力霉素、氟甲砜霉素、已酰氯霉素、甲砜氯霉素对测定CAP 的影响，实验结果如表1 所示。，当干扰物质环境毒素与环境样品CAP 的浓度比为10 时，大多数可能共存的环境抗生素产生的相对误差在5%以下;只有氯霉素碱和氟甲砜霉素带来的的相对误差大于5%。当干扰物质与环境水中CAP 的浓度比为100 时，大多数共存环境抗生素产生的相对误差在11%以下;只有氯霉素碱带来的相对误差超过11%，表明该方法对AFB1 具有很好的选择性。

表1 干扰物质对CAP 分析的影响

3 结语

本文描述了以石英晶体微天平作传感装置的ELISA 法用于分析水体中CAP 的含量。采用竞争酶联吸附免疫分析形式，以HRP－CAP 作标记物，TMB 和H2O2作酶的底物，通过辣根过氧化酶催化氧化TMB 生成沉淀，使石英片谐振频率降低，来测定酶标物和待测物的浓度。免疫传感器对CAP 的检测范围为0.3 ～180 μg·L－1，可以满足水产养殖行业中水质检测的相关要求，它具有装置简单，测量方便，灵敏度高等特点。

［1］郑海明.几种常见鱼病的防治方法［J］.现代农村科技，2011，21:40－41.

［2］解秋菊，许静，王秀娟.水产品中氯霉素的残留状况［J］.食品研究与开发，2012，33:138－140.

［3］华娟，方勤美，熊春娥，等.市售动物源性食品中氯霉素类药物残留量的调查研究［J］.食品安全质量检测学报，2013(4):165－170.

［4］王硕.张晶.邵兵.超高效液相色谱－串联质谱测定污泥中氯霉素、磺胺类、喹诺酮类、四环素类与大环内酯类抗生素［J］.分析测试学报，2013，32:179－185.

［5］虞晓珍，黄百芬，冯靓，等.同位素稀释－超高效液相色谱串联质谱法测定卫生用品中的氯霉素［J］.中国卫生检验杂志，2012，22:2822－2824.

［6］陶昕晨，黄和，李志清，等.水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的HPLC－UVD 法测定［J］.食品工业科技，2012，20:80－83.

［7］张挪威，丁明星，刘国艳，等.基于分子印迹膜的检测牛奶中琥珀酸氯霉素残留传感方法的研究［J］.分析化学，2008(10):1380－1384.

［8］黄常刚，肖永华，李静娜.水产品中氯霉素残留UPLC－MS/MS 测定方法研究［J］.公共卫生与预防医学，2012，23:89－91.

［9］巩军，褚中秋，姜金斗，等.超高效液相色谱——三重四级杆质谱测定乳与乳制品中氯霉素的残留［J］. 中国乳品工业，2012，40:50－52.

［10］李红权，孙良娟，伍志强，等. 高效液相色谱串联质谱法同时测定饲料中氯霉素、甲砜霉素与氟甲砜霉素残留［J］. 分析测试学报，2012，11:1396－1400.

［11］郑萍，梁艳，陈聪，等.PLC－MS/MS 检测鱼肉中氯霉素残留研究［J］.中国卫生检验杂志，2012，22:1520－1522.

［12］张丽君，陆天虹，李时银，等.氯霉素分子印迹聚合膜电极的制备及氯霉素检测［J］.应用化学，2011，28:338－342.

［13］万宇平，罗小华，冯才伟，等.酶联免疫法与液相色谱－串联质谱法测定水产中氯霉素残留［J］.检验检疫学刊，2012，22:45－49.

［14］杨欣，干宁，谢东华，等.基于复合纳米微粒修饰电极的氯霉素快速检测用磁场可控一次性安培免疫传感器研究［J］.化学学报，2010，68:75－82.

［15］谢东华，干宁，王峰，等.鱼肉中氯霉素检测用抗体包被金磁纳米微粒修饰安培免疫传感器［J］. 传感技术学报，2009，22:1371－1377.

［16］史晶晶，廉洁，周稳稳，等.磁敏传感器竞争免疫法检测牛奶中的氯霉素残留量［J］.分析化学，2012，40:1524－1529.