携带增强绿色荧光蛋白基因的人14-3-3σ真核表达载体的构建及其在转染乳腺癌MCF-7细胞的表达

郝 苗，齐凤杰，马 玲

14-3-3已经被发现是广泛分布于多种生物体中的一种高度保守的可溶性酸性蛋白家族,在1967年时由Moore 和Perez对牛脑蛋白系统分类时首次发现,共分为7个亚型,有不同的基因编码[1]。随着克隆技术的发展及14-3-3 cDNA 文库的建立,人们对该蛋白的生物学特性及其功能有了较全面且深入的认识。14-3-3 以同源或异源二聚体的形式存在,与多种细胞蛋白等结合并相互作用。14-3-3σ是14-3-3家族中的重要成员，并且是14-3-3家族中惟一能够被DNA损伤所诱导的成员。大量研究表明，14-3-3σ是细胞周期的负调控因子，它的活化可以使细胞周期停滞于G2/M期，从而抑制细胞的生长。研究发现，14-3-3σ的表达下调能够使人上皮细胞无限制地增殖[2]，这就说明了14-3-3σ表达的降低有助于肿瘤的形成，促进细胞的无限增殖。14-3-3σ在正常的乳腺上皮细胞呈高表达，而在许多种癌中表达下调，包括乳腺癌、宫颈癌、胃癌。

但是14-3-3σ如何调节肿瘤的发展，14-3-3σ的表达是否与肿瘤的恶性程度相关，目前还不是特别清楚。14-3-3σ在人乳腺癌细胞中的表达下降被认为是乳腺癌发生的一个重要原因之一，所以其可以作为人类乳腺上皮癌变的一个特异性标记[3]。本研究旨在通过构建携带增强绿色荧光蛋白基因的14-3-3σ真核表达载体及由脂质体介导转染至乳腺癌MCF-7细胞,观察其蛋白转位,为下一步研究14-3-3σ稳定表达对乳腺癌发展的影响提供实验工具。

1 材料与方法

1.1 工具酶和试剂 乳腺癌MCF-7细胞,胎牛血清(杭州四季青),1640培养基(GIBCO公司),DNAmarker、内切酶BamH I、HindⅢ、聚合酶链反应(PCR)产物回收试剂盒、质粒大量提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒(TaKaRa公司),脂质体2000和G418(GIBICO公司),小鼠抗人14-3-3σ单克隆抗体、β-actin一抗(Santa Crut公司),磷酸盐缓冲液(PBS)、TBE缓冲液、LB培养基(实验室自配)，携带增强绿色荧光重组真核表达质粒pEGFP-GV418(上海吉凯基因化学技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及总RNA的提取 根据GenBank 中已经发表的mRNA 序列(登录号：NM011740)设计带酶切位点的人14-3-3 基因的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)引物。正向引物为：5′-CGAATTCCCATGGAGAGAGCCAGTCTGA-3′(下划线部分为BamH Ⅰ限制性核酸内切酶位点)，反向引物为：5′-GGGGATCCCAGCTCTGGGGCTCCTGG-3′(下划线部分为HindⅢ限制性核酸内切酶位点)。引物合成委托上海吉凯基因化学技术有限公司完成。总RNA的提取与RT-PCR：从HeLa细胞中提取总RNA。按照反转录酶TaKaRa公司的说明书进行RT-PCR扩增获得编码14-3-3 的cDNA序列，PCR扩增反应体系如下：12.5 μl的2 ×GC buferI、2.5 μl dNTP、正义链/反义链引物(20 μmol/L)各1.25 μl、cDNA模板1 μl、PyrobestDNA polymerase 0.15 μl、加去离子水至25 μl。扩增反应条件：94 ℃预变性5 rain，94 ℃变性45 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，反应30个循环，72 ℃延伸10 min，PCR产物命名为SFN，长度747 bp。扩增产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳验证。

1.2.2 克隆载体pCUm-GV142-SFN的构建、鉴定和序列测定 用BamHⅠ和HindⅢ 酶切备用的PCR 产物,胶回收纯化后与同样酶切的pEGFP-N1真核表达质粒在T4连接酶作用下16 ℃过夜连接。连接产物转化DH5a后,取足量菌体涂布于含氨苄西林的LB平板,37 ℃过夜培养。隔日,挑取数个阳性菌落于含氨苄西林的LB培养液中,50 ml摇菌管37 ℃振摇过夜,质粒小抽。用BamHⅠ和HindⅢ双酶切和PCR初步鉴定阳性细菌克隆。将酶切鉴定和PCR正确的细菌克隆所得质粒经酶切后以1% 的琼脂糖电泳初步分析及酶切鉴定后,送上海吉凯基因化学技术有限公司测序。测序正确的质粒经大量扩增后,用去内毒素质粒抽提试剂盒提取质粒,定量后用于细胞转染。

1.2.3 建立稳定转染乳腺癌MCF-7细胞系 乳腺癌MCF-7细胞在含10 %(体积分数)胎牛血清、青霉素、链霉素的1640培养基中,于37 ℃、5 %(体积分数)二氧化碳(CO2)的饱和湿度下培养。待细胞融合至70%～80%时按照LipofectamineTM2000 操作说明书进行空质粒pEGFP-N1 和重组表达载体pCUm-GV142-SFN 的转染。在24孔培养板上,以无血清无双抗的1640培养基培养4 h后进行转染步骤：(1)按影响转染效率的铺板密度(1×104/孔、2×104/孔和4×104/孔)；(2)铺板密度为2×104/孔,固定质粒用量1 μg,作用时间4 h,使用不同量的LipofectamineTM2000转染(1、2、3、5、8和10 μl)；(3)孵育时间;铺板密度为2×104/孔,质粒用量0.5 μg,脂质体用量4 μl,使用不同的孵育时间(2、4、6和8 h),逐一优化转染条件转染，4 h后换成完全培养基。转染后48 h,荧光显微镜观察荧光蛋白表达。用胰蛋白酶消化细胞，在含有G418(700 μg/ml) 的选择性培养基中加压筛选6 周,获得具有抗生素抗性的阳性细胞克隆,扩增培养即为稳定表达14-3-3σ的乳腺癌MCF-7细胞系,命名为MCF-7GV142细胞。

1.2.4 Western blot法检测14-3-3σ表达 转染48 h收集细胞,裂解后提取总蛋白，取20 μg 处理后的蛋白样品，用BCA蛋白定量试剂盒定量后进行12%十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，半干法转移至PVDF 膜上,50 g/L脱脂奶粉室温振荡封闭1 h,与1∶200 稀释后的一抗(鼠抗人14-3-3 单克隆抗体，鼠抗人B-Aetin单克隆抗体)4 ℃孵育过夜,磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗膜3次,10 min/次,然后与1∶5 000 稀释后的HRP标记的羊抗鼠二抗室温孵育2 h,PBST 洗膜3次,10 min/次，最后采用增强化学发光法检测目的蛋白。

2 结果

2.1 特异性条带的获得 提取HeLa细胞总RNA，RT-PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离后得到一条大约800 bp位置的特异条带,与14-3-3 cDNA 的大小完全一致(见图1)。

注：M：Marker，1：14-3-3σ RT-PCR扩增产物

图1 人14-3-3σ RT-PCR扩增产物的鉴定

Figure1 Identification of PCR amplified products of 14-3-3 σ

2.2 真核表达载体pCMV-GV142-SFN的构建及鉴定 重组质粒pCMV-GV142-SFN用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切,得到一条774 bp的目的条带(见图2)。证明目的基因已正确插入质粒GV142,得到了真核表达载体pCMV-GV142-SFN。

图2 酶切鉴定

2.3 DNA序列分析 所获质粒经上海生工生物工程技术服务有限公司测序并与GenBank公布的序(NM_006142.3)比对,同源性100%,无碱基突变(见图3)。

2.4 建立稳定转染乳腺癌MCF-7细胞 据优化后的转染条件,将携带GV142的真核表达质粒转入乳腺癌MCF-7靶细胞,荧光显微镜下观察发现：转染24 h后,乳腺癌MCF-7细胞内可见增强绿色荧光蛋白表达,48 h表达最稳定,72 h可见荧光蛋白淬灭,细胞形态逐渐消失(见图4)。

2.5 Western blot 检测结果 乳腺癌MCF-7细胞克隆中GV142蛋白表达，所构建的真核表达载体已在乳腺癌MCF-7细胞内表达(见图5)。

图3 测序鉴定图

A：转染24 h后,乳腺癌MCF-7细胞内可见增强绿色荧光蛋白表达,B：48 h表达最稳定,C：72 h可见荧光蛋白淬灭

图4 荧光显微镜观察所示

Figure4 Results by fluorescence microscope

注：A未转染乳腺癌细胞，B转染阴性乳腺癌细胞，C转染阳性乳腺癌细胞

图5 Western blot 检测结果

Figure5 Western blot test results

3 讨论

14-3-3通过与其他数百种磷酸化或非磷酸化蛋白结合而发挥其独特的作用。14-3-3σ是14-3-3家族中的重要一种，因能特异地表达于上皮细胞，故被称为人类上皮细胞标志物[4]。作为细胞周期检查点的基因家族成员，负责DNA的损伤修复。在正常细胞周期信号通路传导路径中起着重要效用[5]。在细胞周期中，14-3-3σ位于抑癌基因p53的上游，二者起正性调节作用。其产物可与多种信号蛋白包括磷酸酶、激酶或跨膜蛋白等相互作用[6]，在细胞周期调控、信号转导、细胞分化、细胞增殖、死亡及迁移中发挥重要作用，有文献报道14-3-3 受到多种转录因子的直接调控，通过以下3种可能途径影响转录因子发挥作用：(1)14-3-3σ与转录因子相螯合影响了转录因子与下游基因的DNA结合；(2)14-3-3σ与转录因子相螯合影响了转录因子自身的蛋白水解；(3)14-3-3σ与转录因子相螯合影响了转录因子与其他蛋白的相互作用[7-9]。目前，国内未见人源性14-3-3σ真核表达载体在乳腺癌中作用机制的相关研究[10]。本研究从HeLa细胞总RNA中获得编码14-3-3σ的cDNA，将其克隆入pEGFP-N1载体，构建了人源性14-3-3σ真核表达载体pCMV-GV142-SFN。通过脂质体介导的方法将pCMV-GV142-SFN载体转染HeLa细胞后，Western blot证实转染细胞内14-3-3σ的表达明显增高。这为研究14-3-3σ的功能提供了必要条件，为以后进一步研究14-3-3σ与乳腺癌的发生、发展的关系以及14-3-3σ与转录因子相互作用在乳腺癌发生、发展中的机制研究奠定了实验基础。

1 Mhawech P.14-3-3 proteins——an update[J].Cell Res,2005,15(4):228-236.

2 Ferl RJ,Manak MS,Reyes MF.The 14-3-3s[J].Genome Biol,2002,3(7):REVIEW 3010.

3 Margolis SS,Korbluth S.When the checkpoints have gone:insights into Cdc25 functional activation[J].Cell Cycle,2004,3(4):425-428.

4 Lee J,Kumagai A,Dunphy WG.Positive regulation of Wee 1 by Chkl and 14-3-3 proteins[J].Mol Biol Cell,2001,12(3):551-563.

5 Laronga C,Yang HY,Neal C.et al.Association of the cyclin-dependent kinases and 14-3-3 sigma negatively regulates cell cycle progression[J].J Biol Chem,2000,275(30):23106-23112.

6 Simooka H,Oyama T,Sano T,et al.Immunohistochenilcal analysis of 14-3-3 sigma and related proteins in hyperplestic and neoplastic breast lesions,with particular reference to early carcinogenesis[J].Pathol Int,2004,54(8):595-602.

7 Tan Y，Demeter MR,Ruan H,et al.BAD Ser-155 phosphorylation regulates BAD/Bcl-XL interaction and celI survival[J].J Biol Chem,2000,275(33):25865-25869.

8 Vera J,Schultz J,Lbrahim S,et al.Dynamical effects of epigenetic silencing of 14-3-3sigma expression[J].Mol Biosyst,2010,6(1):264-273.

9 Ferguson AT,Evron E,Umbricht CB,et al.High frequency of hypermethylation at the 14-3-3 sigma locus leads to gene silencing in breast cancer[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(11):6049-6054.

10 Quayle SN,Sadar MD.14-3-3σ sigma increases the transcriptional activity of the androgen receptor in the absence of androgens[J].Cancer Lett,2007,254(1):137-145.