不同乳腺癌细胞冻融抗原负载树突细胞的抑瘤功能研究

曹天泽，高维实，郭慧军，马虎林，施晓辉

树突细胞(DC)是体内最高效能的抗原提呈细胞,在抗肿瘤免疫中处于核心地位[1]。Kjaergaard 等[2]进行的动物模型研究显示,将DC与各种肿瘤抗原相结合构建DC肿瘤疫苗,可有效抑制肿瘤生长。有研究将进展期肾癌患者自体肾癌细胞裂解，将获得的肿瘤抗原制备DC疫苗，使患者免疫状态显著改善[3-4]。张莉等[5]利用细胞因子大量扩增从宫颈癌患者外周血中获得的DC，其表面高表达CD86、CD1a、CD83、HLA-DR等表面分子，此DC能将肿瘤抗原有效提呈给T淋巴细胞，从而在体内外诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对肿瘤细胞的特异性杀伤作用。随着DC培养技术的发展，DC疫苗已经开始进入临床。应用何种方式抗原修饰DC产生良好的抑瘤作用是目前研究的一大热点。本研究分别采用纯化培养的乳腺癌细胞、乳腺癌组织及乳腺癌细胞株SKBR-3所制备的冻融抗原分别负载自体外周血来源的DC，比较3种疫苗的抗原活性，为DC疫苗的临床制备及其应用提供相关的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 纯化培养的乳腺癌细胞(A组)、乳腺癌组织(B组)取自我院肿瘤外科乳腺癌手术患者，均经病理核实。乳腺癌细胞株SKBR-3(C组)购自北京协和医科大学。

1.2 主要试剂 重组人粒细胞-巨细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白介素4(rhIL-4)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)(PEPRO TECH公司)，藻红蛋白(PE)标记小鼠抗人CD80和CD83荧光单克隆抗体、异硫氰酸(FITC)标记小鼠抗人CD86和HLA-DR荧光单克隆抗体(BD公司)。

1.3 方法

1.3.1 纯化培养乳腺癌细胞 无菌条件下获取新鲜肿瘤组织，将“癌巢”部分锐性粉碎，并将获得的肿瘤组织分成等质量的两份(以电子天平称取精确到0.001 g)，一份置于液氮罐中保存备用。另一份以预热的胶原酶V进行消化，经洗涤、计数后接种，以选择性培养基培养，贴壁后去上清及杂细胞，获得患者自体纯化的乳腺癌细胞(见图1)，以病理细胞学检测证实。

1.3.2 制备乳腺癌冻融抗原 培养人乳腺癌细胞株SKBR-3。收集1×105的纯化培养的乳腺癌细胞及SKBR-3，洗涤后制备冻融抗原，采用Lowry法测定蛋白含量，以牛血清蛋白作为标准。根据测定结果，蛋白浓度调至2 mg/ml,用微孔滤膜(0.22 μm)过滤，-86 ℃保存备用。将液氮保存的乳腺癌组织以研钵研磨、超声粉碎仪粉碎后，同上法制备抗原。

1.3.3 诱导DC 按本实验室优化的方法[6]分离外周血的PBMCs，贴壁后去悬浮细胞，完全培养基培养。隔天半换液，维持rhGM-CSF、rhIL-4的终浓度不变，并于第6天在加入TNF-α 30 ng/ml的同时分别加入3组冻融抗原。第7天收获负载了乳腺癌抗原的成熟DC疫苗(见图2)。

图1 纯化培养的乳腺癌细胞

图2 负载抗原的成熟DC疫苗

1.3.4 流式细胞仪分析 用直接荧光标记法标记后，进行流式细胞仪分析。调整DC疫苗的悬液细胞密度至5×105/ml,各取50 μl细胞悬液，分别加入20 μl与其相应的抗体工作液，摇匀、避光，室温下孵育20 min。磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，立即上机检测。每个样本数>5×104。获取样本中1×104阳性表达率。用同型IgG相应阳性对照。

1.3.5 DC疫苗刺激T淋巴细胞增殖能力的检测 用尼龙毛法获取外周血T淋巴细胞,调节T淋巴细胞及3组DC疫苗浓度均为5×104/ml，将3组疫苗分别加入96孔板,按照1∶1比例加入T淋巴细胞，每种比例设6个复孔,静置培养3 d。混合培养结束前12 h加入3H-TdR,每孔实际放射比活度为1 μCi，用Beckman液闪计数仪测量CPM值,以空白T细胞孔及空白DMEM培养基孔分别作为对照检测。

2 结果

2.1 3组的CD80、CD83、CD86和HLA-DR比较 诱导7 d后，3组DC的CD80、CD83、CD86和HLA-DR比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其中A、C组与B组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；A组与C组比较，差异均无统计学意义(P>0.05，见表1)。

表1 3组CD80、CD83、CD86和HLA-DR比较

注：与B组比较，*P<0.05

2.2 3组CPM值比较 A组CPM值为(13 047±215)，B组为(4 964±148)，C组为(5 082±176)，3组比较差异有统计学意义(F=5 200.7159，P=0.0000)；其中A组与B、C组比较差异均有统计学意义(q值分别为125.8166和123.9803，P<0.01)；B组与C组比较，差异无统计学意义(q=1.8363，P>0.05)。

3 讨论

DC作为最有效、功能最强的抗原递呈细胞,在肿瘤免疫研究中具有独特的地位。近年来随着对DC生物学特性研究的进展，以DC为佐剂的免疫疗法已应用在一些恶性肿瘤治疗的临床研究中，取得了令人满意的疗效[7-8]。在体内，DC可直接进入肿瘤区域获得肿瘤抗原，并向T淋巴细胞呈递抗原，从而诱发CTL反应。DC作为抗原专职递呈细胞，其成熟度与其生物学功能密切相关，未成熟的DC具有很强的捕获、加工处理抗原的能力。而成熟的DC则高表达共刺激分子，具有很强的将肿瘤抗原递呈给T细胞的能力。肿瘤患者由于缺乏专职抗原递呈细胞的有效递呈，导致初始型T细胞与肿瘤细胞的相互作用耐受或无能，阻碍T细胞介导的抗肿瘤免疫有效激活[9]。从目前的研究来看，DC疫苗的抗癌作用是肯定和安全的，但所知的肿瘤特异性抗原很少且无法应用在临床治疗中，而冻融抗原修饰DC具有显著的治疗效果[10]。岳玲玲等[11]也证实在冻融抗原负载DC阳性细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的实验中应用低效靶比获得较好的杀伤效能。因此本研究选用反复冻融法制备全肿瘤细胞抗原致敏DC。肿瘤冻融抗原包括了胞膜和胞内抗原，其特异性低但个体化特点明显，可诱导机体产生多克隆的CD8+CTL和 CD4+CTL，从而产生较强的抗肿瘤免疫效应。此结果进一步验证了全抗原融合疫苗体外实验可显著增强抗肿瘤免疫效应[12]。

本研究旨在比较不同的冻融抗原所致敏的DC疫苗的抗原活性有无差异。结果显示，3种不同冻融抗原致敏的DC疫苗在流式细胞表型检测及T淋巴细胞增殖反应中有显著差异。细胞株抗原组与纯化的肿瘤细胞抗原组均具有较高的细胞表型，但在自体的T淋巴细胞增殖实验中，纯化培养的乳腺癌细胞组表现出较强的抗原活性，在负载DC后，其所介导的抗肿瘤免疫要优于乳腺癌细胞株SKBR-3组，其原因尚未清楚，是否在自体抗原中包括了更多的个体化的、尚未被发现的抗原分子或者是在DC分子表面具有更加严格的个体化的抗原受体表位，还有待于进一步研究。

目前，以各种基因、蛋白提取物及某些抗原肽作为佐剂的报道很多，也均在体外实验中取得了较好的实验结果。但在体内实验中，以某一种基因或抗原肽负载DC的肿瘤免疫治疗并没有取得预想的临床效果，究其原因可能与已知的肿瘤抗原很少、有些肿瘤缺乏特异性抗原、负瘤的机体由于肿瘤内环境所导致的免疫耐受以及机体的免疫呈递功能低下有关。

Rosenblatt等[13]认为将DC和肿瘤细胞进行融合是刺激机体产生针对肿瘤的CTL反应的有效疫苗，并可诱导机体产生有力的溶瘤作用，就是使肿瘤细胞的全部抗原提呈给DC，继而激发机体产生特异性抗肿瘤反应。这种方法避免了使用单一抗原或基因等佐剂作为靶抗原的缺点，而是为T淋巴细胞提呈了肿瘤的全套抗原，从而产生更强的免疫应答。

综上所述，将细胞的全部抗原提呈给DC可以很好地激发机体产生特异性抗肿瘤反应，但是如何更完整地保留肿瘤的全部抗原又以怎样的方式与DC结合，还有待于进一步研究。

1 Ferrari S,Rovati B,Porta C,et al.Lack of dendritic cell mobilization into the peripheral blood of cancer patients following standard or high-dose chemotherapy plus granulocyte-colony stimulating factor[J].Cancer Immunol Immunother,2003,52(6)：359-366.

2 Kjaergaard J,Shimizu K,Shu S.Electrofusion of syngeneic dendritic cells and tumor generates potent therapeutic vaccine[J].Cell Immunol,2003,225(2)：65-74.

3 Li H,Wang C,Yu J,et al.Dendritic cell-activated cytokine-induced killer cells enhance the anti-tumor effect of chemotherapy on non-small cell lung cancer in patients after surgery[J].Cytotherapy，2009，11(8):1076-1083.

4 Wang Z,Hu Q,Han W,et al.Effect of dendritic cell vaccine against a tongue squamous cell cancer cell line(Tca8113) in vivoand in vitor[J].Int J Oral Maxillofac Surg,2006,35(6):544.

5 张莉，王雪峰.子宫颈癌患者树突状细胞体内外诱导抗肿瘤免疫[J].中国全科医学，2008，12(1)：21-23.

6 曹天泽，高维实，郭慧军，等.诱导高纯度树突状细胞的研究[J].内蒙古医学杂志，2009,41(9):1025-1028.

7 王健，张永泽，潘丽兰，等.rhHSP70对食管癌细胞RNA转染的脐血树突状细胞诱导CTL抗肿瘤功能的影响[J].疑难病杂志，2011，10(1)：45.

8 元建华，彭大为，李建旺，等.晚期结直肠癌患者树突细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞治疗效果研究[J].中国全科医学，2011，14(12)：4139.

9 Mosca PJ,Lyerly HK,Clay TM,et al.Dendritic cell vaccines[J].Front Biosci,2007,12:4050-4060.

10 Lambert LA,Gibson GR,Maloney M,et al.Intranodal immunization with tumor lysate-pulsed dendritic cells enhances protective antitumor immunity[J].Cancer Res,2001,61(2)：641-646.

11 岳玲玲，张连生，柴晔，等.负载抗原的DC与CIK共培养对耐药乳腺癌细胞的杀伤作用[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2012，19(4):437-441.

12 张鹏，刘瑞磊，姜华，等.三阴乳腺癌细胞-树突状细胞融合疫苗的抗肿瘤免疫效应[J].南方医科大学学报，2012,32(6):779-783.

13 Rosenblatt J,Vasir B,Uhl L,et al.Vaccination with dendrtic cell/tumor fusing cells results in cellular and homoral antitumor immune reponses in patients with multipul myeloma[J].Blood,2011,117(2):393-402.