MicroRNA-143对人乳腺癌MCF-7细胞侵袭和迁移的影响

李斐铭 葛晓英 王超群 黄必飞

●基础研究

MicroRNA-143对人乳腺癌MCF-7细胞侵袭和迁移的影响

李斐铭 葛晓英 王超群 黄必飞

目的 探讨microRNA-143（miR-143）对人乳腺癌MCF-7细胞侵袭、迁移和增殖的影响。方法在脂质体介导下将miR-143抑制剂（miR-143 inhibitors）转染入MCF-7细胞，以inhibitor negative control（inhibitor NC）作为阴性对照。通过MTS试剂盒检测细胞增殖能力，以Transwell侵袭实验和迁移实验分别检测细胞侵袭能力和迁移能力。结果（1）miR-143 inhibitors组与inhibitor NC组间细胞增殖活性无明显差异（P＞0．05）；（2）Transwell侵袭及迁移实验显示转染miR-143 inhibitors后，MCF-7细胞的侵袭及迁移能力均明显增强（P＜0．05）。结论miR-143对人乳腺癌MCF-7细胞的侵袭及迁移能力存在负性调控作用，可能成为乳腺癌治疗的潜在靶点。

miR-143 Transwell侵袭 迁移 增殖

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the effect of microRNA-143(miR-143)on invasion,migration and proliferation potential of human breast cancer MCF-7 cells．MethodsMCF-7 cells were transfected with miR-143 inhibitors by lipofectamine．MCF-7 cells transfected with inhibitor negative control were used as negative control(inhibitor NC)．Cell proliferation potential was evaluated by MTS kit,cell invasion potential and migrating ability were detected by transwell invasion and migration assay．ResultsThere were no significantly differences in cell growth between cells transfected with miR-143 inhibitors and inhibitor NC cells(P＞0．05)．Transfection of miR-143 inhibitors into MCF-7 cells led to a significant increase in cell invasion and migration detected by transwell invasion and migration assay(P＜0．05)．Conclusion MiR-143 negatively regulates the invasion and migration potential of human breast cancer MCF-7 cells and may be a potential target for breast cancer treatment．

MicroRNAs（miRNAs）是由长约20～24个核苷酸组成的非编码小RNA，通过抑制靶mRNA翻译或降解靶mRNA来调节基因的功能，在生理或病理过程中发挥着重要的作用，如细胞增殖，分化，肿瘤的发生和发展等[1-2]。Iorio等[3]研究发现，相对于正常乳腺组织，miR-143在乳腺癌中表达明显下调。目前有研究表明miR-143显著抑制食管鳞状细胞癌等肿瘤细胞侵袭迁移[4-5]，但其是否也参与调控乳腺癌侵袭转移尚未见文献报道。因此，本研究选择乳腺癌细胞株MCF-7为模型，通过转染miR-143抑制剂（inhibitors）抑制MCF-7细胞中miR-143表达，以探讨miR-143对乳腺癌细胞侵袭、迁移和增殖的影响。

1 材料和方法

1.1 细胞株 人乳腺癌细胞株MCF-7购自上海拜力生物科技有限公司。

1.2 主要试剂与耗材 RPMI-1640培养基、胎牛血清（FBS，美国Hyclone公司产品)，OPTI-MEM(美国GIBCO公司产品），LipofectamineTM2000转染试剂（美国Invitrogen公司产品），MTS细胞增殖/毒性检测试剂盒(美国Promega公司产品），Transwell侵袭小室（美国Corning公司产品），基质胶（美国BD公司产品），miR-143 inhibitors及negative control（NC，上海吉玛公司产品）。miR-143 inhibitors序列为5′-GAGCUACAGUGCUUCAUCUCA-3′；inhibitor NC序列为5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′。

1.3 仪器和设备 细胞培养超净工作台(上海智城分析仪器有限公司产品），全波长多功能酶标仪（美国BIORAD公司产品），CO2恒温细胞培养箱 (美国Thermo公司产品），倒置显微镜（日本Olympus公司产品），微量移液器（德国Eppendorf公司产品），显微图象采集系统（日本尼康公司产品）。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养 MCF-7细胞用含10%FBS的RPMI-1640培养基在37°C恒温、5%CO2的培养箱中培养。

1.4.2 转染及实验分组 miR-143 inhibitors及inhibitor NC干粉离心后加适量焦碳酸二乙酯（DEPC）水配制成终浓度为20μM的工作液。取6孔板接种细胞后（每孔加入浓度为1×105个细胞/ml的细胞悬液2ml），按照LipofectamineTM2000说明书进行转染。分为两组：inhibitor NC组和miR-143 inhibitors组。

1.4.3 MTS法检测细胞增殖 取6孔板中转染后24h的MCF-7细胞，以每孔4×103个细胞接种于96孔板。每组设6孔。接种96孔板后24、48、72、96h各检测一块板。检测时每孔加20μl MTS检测试剂，并设置调零孔。置于37°C、5%CO2培养箱中孵育2h，用酶标仪测定490nm波长吸光度值（OD490）。实验重复3次。

1.4.4 Transwell侵袭及迁移实验 取6孔板转染48h MCF-7细胞，用无血清RPMI-1640培养基培养12h后，每个侵袭小室接种1×105个细胞。每个侵袭小室下室加含10%FBS的RPMI-1640培养基600μl。其中侵袭实验在小室接种细胞前加60μl基质胶（基质胶用无血清RPMI-1640培养基稀释成浓度为1∶8），而迁移实验不加基质胶。迁移及侵袭实验分别在37°C、5%CO2培养箱中培养24、28h后，取出小室用90%乙醇固定，0.1%结晶紫溶液染色，置于显微镜下观察，选取4个低倍视野（×100）拍照并细胞计数，计算平均值。实验重复3次。

1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件，测得计量资料以表示，两组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 miR-143 inhibitors对MCF-7细胞增殖能力的影响 见图1。

由图1可见，细胞接种96孔板24、48、72、96h（即转染48、72、96和120h）后，miR-143 inhibitors组和inhibitors NC组之间OD490值均无统计学差异（均P＞0.05）。

2.2 转染miR-143 inhibitors后细胞侵袭及迁移能力的变化 miR-143 inhibitors组侵出小室的细胞数较inhibitor NC组均明显增加（P＜0.05），详见图2、3。

图1 miR-143 inhibitors对MCF-7细胞增殖能力的影响

图2 两组Transwell侵袭及迁移实验镜下图片（a、b:侵袭；c、d:迁移；结晶紫溶液染色，×200）

图3 两组每低倍镜视野（×100）的平均穿膜细胞数比较（*P＜0.05）

3 讨论

近年来，随着miRNAs在肿瘤中的具体作用及其机制研究的不断深入，越来越多的与肿瘤发生、发展相关miRNAs被发现。肿瘤中不同的miRNA表达上调或下调，提示编码miRNA的基因可能起着癌基因或者抑癌基因的复杂作用[6]。研究表明，miRNAs通过影响癌细胞黏附、迁移、侵袭及肿瘤血管生成等对肿瘤进展过程中多个步骤起了调控作用[7]。

研究表明，miR-143在包括胰腺癌、食管鳞状细胞癌、膀胱癌及结直肠癌等多种肿瘤细胞中表达显著下调[4-5，8-9]，其中Hu等[4-5]发现miR-143能显著抑制胰腺癌细胞和食管鳞状细胞癌细胞的侵袭、迁移能力。这些结果表明，miR-143可能起着抑制肿瘤发生发展的功能。在乳腺癌中，Iorio等[3]研究不同miRNAs的表达改变，发现miR-143在乳腺癌中相对正常乳腺组织表达明显下调。然而，关于miR-143是否参与调控乳腺癌侵袭转移尚未见文献报道。因此，为了明确miR-143对乳腺癌细胞侵袭、迁移和增殖的作用，我们将miR-143 inhibitors转染至MCF-7细胞中，观察其在MCF-7细胞中的作用，结果表明抑制miR-143表达对细胞增殖无明显影响，但能够显著增强MCF-7细胞侵袭及迁移能力，表明miR-143对人乳腺癌细胞侵袭和迁移具有负性调控作用。

研究表明过表达miR-143抑制食管鳞状细胞癌、膀胱癌、宫颈癌、结直肠癌及乳腺癌等多种肿瘤细胞增殖能力[5，8-11]。其中Noguchi等[8]研究表明miR-143和miR-145过表达对膀胱癌T24细胞和NKB1细胞增殖能力起显著抑制作用，且两者存在协同作用，但因膀胱癌SNK57细胞系中miR-143和miR-145表达水平高于T24和NKB1细胞系，因此miR-143和miR-145对其增殖能力无明显影响。Yu等[11]发现上调miR-143表达可显著抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖能力。然而在我们的研究中，抑制miR-143表达对MCF-7细胞增殖能力无明显影响。结合上述的研究结果，我们认为可能的原因是乳腺癌MCF-7细胞中miR-143表达低，因而抑制其表达不足以引起细胞增殖能力的显著改变，有待于进一步证实。

关于miR-143调控肿瘤发生、发展的机制，Yu等[11]证实miR-143以肿瘤细胞增殖相关基因bcl-2和survivin为靶点影响乳腺癌细胞增殖。在结直肠癌中，miR-143被证实以癌基因KRAS为靶点抑制其增殖[10]。另有研究表明miR-143以细胞外信号调节激酶5（ERK-5）为靶点抑制食管鳞状细胞癌细胞增殖及侵袭、迁移[5]。 miR-143亦可通过调控pI3K/Akt及MAPK信号通路影响膀胱癌细胞增殖[8]。那么，miR-143是通过什么途径调控乳腺癌细胞侵袭、迁移的呢?我们将在进一步研究中证实这个问题。

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Effect of microRNA-143 on invasion and migration potential of human breast cancer MCF-7 cells

MiR-143 TranswellInvasion Migration Proliferation

2013-01-23）

（本文编辑：沈昱平）

浙江省医药卫生科技计划项目（2012KYB230）

322100 东阳市人民医院病理科（李斐铭、王超群、黄必飞）；东阳市妇幼保健院妇科（葛晓英）

李斐铭，E-mail：dyhospital@163.com