LRRK2基因G2385R突变与帕金森病相关性研究

李彬斐 郑昌华 王希佳 陈亨平 张小罗

LRRK2基因G2385R突变与帕金森病相关性研究

李彬斐 郑昌华 王希佳 陈亨平 张小罗

目的探讨LRRK2基因G2385R突变与中国沿海地区汉族人群帕金森病（PD）相关性，分析LRRK2基因多态在PD发病中的作用。方法收集PD患者197例（PD组）、健康对照者202例（对照组）的临床资料与基因组DNA。检测PD患者G2385R基因型；测定变异携带者及非携带者DNA序列。分析G2385R基因型在PD组和对照组中分布频率及其与性别、年龄相互作用，统计G2385R变异人群归因危险度百分比。结果PD组[19例（9．64%）]患者GA基因型高于对照组[5例（2．48%）]（χ2=9．07，P＜0．01，OR=5．04，95%CI=2．16～11．78）。人群归因危险度百分比7．82%。未发现AA基因型。晚发型PD患者GA基因型为9．80%，与对照组（2．23%）比较，差异有统计学意义（P＜0．01，OR=4．35，95%CI=1．76～12．93）。携带G2385R患者与非携带患者临床表型在性别、发病年龄、临床症状、UPDRS评分及Hoehn-Yahr分级差异均无统计学意义（均P＞0．05）。结论LRRK2基因G2385R变异在中国沿海地区汉族人群中与晚发性PD相关，存在不同地区差异。

帕金森病 G2385R基因型 单核苷酸

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the association between G2385R polymorphisms of LRRK2 gene and Parkinson's disease(PD)．MethodsThe clinical data and peripheral blood samples were collected from 197 PD patients and 202 healthy subjects．Polymerase Chain Reaction combined with restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)was used to detected the G2385R genotypes of PD patients,the G2385R genotype was verified by the sequencing．The sex,age,clinical symptoms, UPDRS score and Hoehn-Yahr grade were compared among PD patients with different genotypes．The frequencies of genotype distribution of PD patients and healthy subjects were compared．The population attributable risk percent(PAR%)of G2385R variations was counted and the synergy with gender and age interaction was analyzed．ResultsThe genotype GA of G2385R was detected in 19 cases of PD(9．64%),while that was detected in 5 controls(2．48%)(χ2=9．07,P＜0．01,OR=5．04,95%CI:2．16～11．78) and the PAR%of 7．82%was gained．No PD patient with AA genotype was found．The genotype GA was detected in 15 cases of late-onset PD(9．80%),in the age-matched controls,there were only 4 subjects of GA genotype(2．23%)(P＜0．01,OR=4．35,95% CI:1．76～12．93)．There were no significant differences in clinical phenotypes(sex,age,clinical symptoms,UPDRS score and Hoehn-Yahr grade）between patients carrying G2385R and those not carrying．ConclusionThe G2385R variant in LRRK2 gene may be a risk factor of the late-onset Parkinson's disease in Han Chinese patients．

帕金森病（PD）是常见神经系统变性病，其病因、发病机制尚未明确。LRRK2基因突变出现在家族性帕金森综合征频率很高，其变异具有种族差异[1-2]。LRRK2基因G2385R突变主要在亚洲人群中，在新加坡、中国大陆和台湾地区人群以及日本、韩国的独立研究中均发现G2385R与PD发病相关[3]。目前在中国有关G2385R基因型与PD相关性研究报道来自上海及四川[4-5]，关于中国沿海地区人群G2385R基因型与PD发病关系鲜有报道。本文通过中国沿海地区人群LRRK2基因G2385R突变型病例对照研究，探讨LRRK2基因多态在中国沿海地区汉族人群PD发病中的作用。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集温岭市中医院及温岭市第一人民医院2009-03—2011-10门诊及住院PD患者197例为PD组（温岭市中医院107例，温岭市第一人民医院90例）。男117例，女80例，年龄29～81（60.3±11.5）岁，发病年龄15～82（57.1±11.4）岁。其中早发PD（发病年龄≤50岁，EOPD组）者44例，发病年龄15～50岁（43.4±6.5）岁。晚发PD（发病年龄＞50岁，LOPD组）153例，发病年龄51～82（64.8±7.4）岁。所有患者根据英国BrainBank标准确诊为PD，由专人详细记录并核实患者的发病年龄、发病症状及治疗反应，实行UPDRS评分及Hoehn-Yahr分级。温岭市中医院同期健康体检202例为对照组，男105例，女97例，年龄19～81（58.2±11.8）岁；202例中包括PD患者的健康配偶27例。所有受试者彼此间无血缘关系，且一级亲属中无PD患者。两组研究对象在性别、年龄差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究获得医院伦理委员会同意，并获得入选者及监护人知情同意。

1.2 方法

1.2.1 标本处理 采用DNA提取纯化试剂盒（德国Qiagen公司），PCR扩增试剂盒（美国Promega公司），Big-dye v3.1测序试剂盒（美国ABI公司），DYY-Ⅳ型电泳仪槽（北京六一仪器厂），L-21M高速冷冻离心机（上海赛特湘仪器公司）进行标本处理。取外周静脉血样本2ml（含ACD抗凝剂0.4m1）加入3ml红细胞裂解液混匀，室温5min，1 000r/min离心2min，移去上清液，留约100μl残留液，摇匀使白细胞重新悬浮，5 000r/min离心2min，吸去上清液，收集白细胞悬浮液50μl。

1.2.2 基因组DNA提取及纯化 按照DNA提取纯化试剂盒操作步骤，结果采用凝胶电泳检测，紫外仪观察DNA大小，D2 000 Marker标准对照。

1.2.3 PCR扩增 根据NCBI及 ensembl基因库中G2385R所在Exon48的DNA序列，设计G2385R引物序列，上游PF：5′-TAGCCCTGTTGTGGAAGTG-3′；下游PR：5′-TTCAGAGGAAGAAAGGAAG-3′。反应体系：10×缓冲液2.5μl，50pmol/μl上下游引物0.5μl，20mmol/L dNTP0.5μl，DNA模板100ng，TaqDNA酶0.5μl，去离子水补至25μl。反应程序：94℃预变性2min，然后94℃30s，61℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环；最后72℃延伸15min。结果取5μl PCR产物，于1%琼脂糖凝胶，观察产物片段大小170bp。

1.2.4 限制性片段长度多态性分析 （1）酶切反应。取PCR产物16μl，10×缓冲液2μl，AccI酶5U，加双蒸水至30μl。37℃酶切过夜24h。结果取5μl PCR产物，于1%琼脂糖凝胶，紫外仪观察。（2）基因型分析。GG型纯合子170bp（野生型、没有酶切位点）；GA型杂合子170bp+123bp；AA型纯合子123bp。

1.2.5 PCR产物测序 由北京奥康生物技术公司完成，PCR产物用Qiaquick柱（Oiagen公司）过柱纯化并定量。Big-dye v3.1测序kit对PCR纯化产物进行测序，测序引物为单向引物。5μl反应体系中含待测模板150ng、单向引物3.2pmol、Big-dye v3.1mix 0.5μl。ABI 9700型扩增仪反应，反应结束后，产物进行纯化，加入高纯Hi-Di甲酰胺10μl溶解，ABI 3730基因测序仪进行检测。检测序列与基因组LRRK2基因标准序列比对。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件，验证入选人群是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律分别采用χ2、t检验。

2 结果

2.1 LRRK2基因G2385R基因型的检测 LRRK2基因G2385R扩增产物为170bp，经AccI酶切后，G等位基因无酶切位点仍为170bp片段；A等位基因切为123bp和47bp两个片段，47bp条带泳出凝胶未能显示；GG基因型为单个170bp；GA基因型为170bp、123bp两个条带，AA基因型为123bp单个条带。

2.2 LRRK2基因G2385R位点序列测定 测序结果见图1。

图1 LRRK2基因G2385R（C.7153G＞A）SNP位点测序图（上图为正常序列，下图为杂合序列）

2.3 PD组和对照组G2385R基因型和等位基因检测结果 将PD组分为男性PD组和女性PD组、EOPD组和LOPD组，将对照组分为男性对照组和女性对照组、EOPD对照组和LOPD对照组，分别比较LRRK2基因G2385R基因型频率和等位基因频率，见表1。

由表1可见，PD组中，LRRK2基因G2385R杂合携带者19例，GA基因型频率9.64%，A等位基因频率4.82%；对照组中LRRK2基因G2385R杂合携带者5例，GA基因型频率2.48%，A等位基因频率1.24%。所有研究对象均未检测出AA基因型。统计学检验表明PD组与对照组基因型观测值与期望值符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律（PD组χ2=0.84，P＞0.05；对照组χ2=0.03，P＞0.05）。PD组的基因型及等位基因频率变异均明显高于对照组，有显著统计学意义（χ22=9.07，P＜0.01；χ2=8.79，P＜0.01）。基因型及等位基因频率在PD组与对照组、男性PD组与男性对照组、女性PD组与女生对照组、LOPD组与LOPD对照组比较，差异均有显著统计学意义（P＜0.01）；而EOPD组与EOPD对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 G2385R基因型频率和等位基因频率分布[例（%）]

2.4 G2385R多态的单因素Logistic回归分析 见表2。

表2 G2385R多态的单因素Logistic回归分析[例（%）]

由表2可见，携带GA基因型者在男性PD组中发病风险是未携带者4.04倍，在女性PD组中发病风险是未携带者6.73倍。LOPD组中，GA基因型的PD发病风险是未携带者4.35倍。

2.5 G2385R、性别、起病年龄及其相互作用的多因素Logistic回归分析 见表3。

表3 G2385R、性别、起病年龄及其相互作用的多因素Logistic回归分析

由表3可见，Logistic分析经过性别、起病年龄校正后，G2385R变异携带者PD发病风险是未携带者5.04倍（P＜0.01）。

2.6 LRRK2基因G2385R人群归因危险度百分比 采用G2385R变异OR值作为相对危险度估计值，对照组中G2385R变异（即GA+AA基因型）频率作为一般人群风险基因型频率，估算出G2385R变异人群归因危险度百分比（PAR%）为7.82%。

2.7 基因型同临床表型关系 见表4。

表4 G2385R变异携带者和非携带者的临床特征比较

由表4可见，G2385R变异携带者和非携带者临床特征比较，在性别、起病年龄、起病时症状、UPDRS评分和Hoehn and Yahr评级等方面，携带者与非携带者差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

3 讨论

G2385R被报道是第一个中国人特异的PD可能风险因子[4-5]。易感基因多态性与疾病相关性有统计学意义时，有3种可能：（1）等位基因通过改变氨基酸序列或稳定性等影响基因功能，进而影响发病危险性；（2）等位基因与实际引起疾病基因位点连锁不平衡；（3）假阳性（Ⅰ型错误）[5-6]。本研究结果G2385R变异与中国沿海地区汉族人群散发性PD发病密切相关，可增加PD发病风险，与以前研究相同[4-6]。多因素Logistic回归分析显示，变异携带者发病风险相对于非携带者是5.04倍，与中国大陆其他地区研究结果相比存在以下差别：首先，An[4]报道四川大学华西医院神经内科门诊就医PD患者中G2385R变异频率11.8%，对照组3.3%；Li[5]报道G2385R上海瑞金医院门诊就诊PD患者中的频率5.96%，对照组为0，两者在PD组及对照组中分布频率差异均较大。本研究显示G2385R变异频率在PD中9.64%，对照组中2.48%。其次，An[4]报道G2385R变异在年轻人群及年老人群均同PD相关，其中ELPD组发病风险比LOPD组高。Li等[5]报道两者发病风险无差别。本研究数据G2385R变异在年轻人群中与PD无相关，与年老人群PD发病具有相关性，是沿海地区汉族人群LOPD可能风险因子。第三，Li等[5]报道G2385R变异分布频率女性患者明显高于男性患者，性别与年龄在PD发病风险中具有交互作用。本研究结果G2385R变异频率在男性患者及女性患者差别无统计学意义，性别与年龄在PD发病中无交互作用。本研究和大陆以前研究存在差别原因可能为以下情况，中国大陆不同地区种族、环境、生活习俗差别较大。本研究对象来自中国大陆浙江省温岭市，温岭市为中小城市，相对上海、成都等大城市较少外来移民，同其他地区通婚也较少，研究对象同质性较高，同时生活习俗同其他地区差异较大，因此出现以上差别。

本文根据发病风险OR值作为相当危险度RR，对照组风险基因频率作为一般人群总的暴露率，计算出G2385R人群归因危险度百分比（PAR%）为7.82%，高于国外研究结果[6]。人群归因危险度百分比是总体人群中某种疾病归因于某种因素暴露所引起发病占全部发病比例，消除这个危险因素后，所产生对预防该疾病的效果将占有多大比重。目前中国55岁以上人口中有170万PD患者，随着人口老年化，还将继续增加。按照本文获得PAR%，推算出因暴露G2385R变异而发病患者数量较多，因此，研究G2385R在PD发病机制中作用，寻找针对性治疗措施具有重要意义。

临床表型方面，携带G2385R的PD患者与非携带者在性别、发病年龄、病程、临床症状、UPDRS评分及Hoehn and Yahr分级均差异无统计学意义。静止性震颤，运动迟缓是携带者常见起病症状，所有携带者对左旋多巴都有阳性反应，是典型特发性PD症状，与以前报道研究相同[3-6]。来自中国大陆2份研究报道，在携带者起病年龄方面存在争论。Li[5]报道携带者起病年龄相对较迟，有较长病程，但没有统计学差异；相反的，An[4]报道携带者起病年龄较早，尤其在LOPD组具有明显统计学差异。本文结果显示，PD患者中携带者起病年龄比非携带者年轻，尤其LOPD组有较明显趋势，但均未达到统计学意义，有必要进一步扩大样本量，以确定G2385R变异是否影响了PD起病时间。G2385R变异携带者可能出现抗凋亡作用减弱，在基因与基因或基因与环境因素的相互作用下诱发PD。G2385R变异致病机制目前仍未清楚，需要进一步研究。

总之，本研究结果显示G2385R变异与中国沿海地区汉族人群PD具有相关性，与早发性PD无相关性，携带变异患者具有典型PD临床表现。

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Association between G2385R polymorphisms of LRRK2 gene and Parkinson`s disease

Parkinson’s disease G2385R genetype Single nucleotide

2012-08-23）

（本文编辑：杨丽）

317500 温岭市中医院（李彬斐、陈亨平、张小罗）；温岭市第一人民医院（郑昌华、王希佳）

郑昌华，E-mail：zhengchanghua0402@163.com