头颈部鳞癌中ALDH1、α-SMA的表达及其意义

陈超 魏燕 葛明华

头颈部鳞癌中ALDH1、α-SMA的表达及其意义

陈超 魏燕 葛明华

目的研究头颈部鳞癌（HNSCC）中ALDH1和α-SMA的表达情况及其与肿瘤转移和分期的关系。方法通过免疫组化双染在60例HNSCC标本上对ALDH1和α-SMA的表达水平和分布情况进行研究，同时利用Real-time PCR对其mRNA表达情况进行半定量分析比较，结合病例临床病理资料研究加以分析。结果ALDH1在HNSCC中有不同程度的表达，其表达水平与头颈肿瘤分期及淋巴结转移间关系紧密，并具有统计学意义；α-SMA阳性的细胞主要分布与肿瘤-正常组织交界处，其表达强弱与淋巴结转移与否密切相关，α-SMA在分化差的病例中表达有增高趋势但无统计学意义；ALDH1和α-SMA的表达在有转移的肿瘤中具有高度协同性。结论ALDH1和α-SMA可分别或相互组合作为判断HNSCC有无转移的指标。

头颈部鳞癌 α-平滑肌肌动蛋白 乙醛脱氢酶1

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the expression of ALDH1 and α-SMA in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC)and its clinicopathological significance．MethodsThe clinical and pathological data of 60 cases of HNSCC were collected．The expression of ALDH1 and α-SMA proteins was examined by immunohistochemical double staining on paraffin sections;and the ALDH1 and α-SMA mRNA levels were determined by semi-quantitative real-time PCR．ResultsThe expression of ALDH1 was closely correlated with tumor stage and lymph node metastasis in HNSCC．The α-SMA positive cells were mainly located at the invading border of tumor and its expression level was closely correlated with lymph node metastasis．There was a tendency of increased α-SMA positive cells in poorly-differentiated cancers;however,there was no statistical difference．ALDH1 and α-SMA expression showed a high coincidence in tumors with positive lymph nodes．ConclusionsALDH1 and/or α-SMA might be good indicators for prediction of lymph node metastasis in HNSCC．

新近研究发现肿瘤间质与肿瘤的侵袭、转移有密切联系。我们的前期研究[1]中发现在头颈部鳞癌（HNSCC）中，肌纤维母细胞在体外可由上皮性肿瘤细胞经上皮-间质转换（EMT）转变而来，同时高表达α-SMA和ALDH1。本文对ALDH1和α-SMA在HNSCC中的表达分布与肿瘤转移、分期及预后的相关性进行分析，以探讨其临床价值。

1 资料和方法

1.1 一般资料 从浙江省肿瘤医院标本库中选取60例HNSCC石蜡标本，时间跨度为2005至2010年，所有病例均有明确的病理诊断，男44例，女16例，年龄34～72岁。按有无淋巴结转移分为转移组（N+）36例，无转移组（N0）24例，其中口腔癌22例、口咽癌18例、下咽癌20例；根据组织学情况分为高、中、低分化组，具体pTNM分期情况见表1。

表1 60例HNSCC病理及pTNM分期

1.2 方法

1.2.1 免疫组化双染 标本石蜡切片进行常规脱蜡、逐级水化，抗原修复采用Epitope Retrieval solution（DAKO），95～100℃,20 min。阻断内源性过氧化物酶，抗原封闭。加入anti-ALDH1一抗（1∶400，美国BD公司产品）室温孵育1h，充分冲洗后加入生物素标记的二抗，室温孵育30min，利用streptavidin-AP试剂盒进行显色。冲洗后加入小鼠血清，孵育5min封闭多余二抗，加入anti-α smooth muscle actin（α-SMA，1∶50）室温孵育30min，冲洗后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，继续孵育30 min，加入DAB进行显色，苏木素染色显示细胞核，冲洗后封片，显微镜下观察。依据相关文献报道的方法，综合考虑切片中阳性细胞所占观察细胞数的百分比和阳性细胞着色强度两项指标，半定量判定结果。根据着色强度判断阳性程度：标本无色为0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。根据阳性细胞所占观察细胞数的百分比，随机选取10个高倍镜典型视野（×400）约200个细胞。阳性细胞数≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。两项指标的乘积即为最终的总积分，按其将结果分为4级：0～3为（-），4～5为（+），6～7为（++），8分以上为（+++），将前两者归为低表达，后两者为高表达。

1.2.2 荧光定量PCR检测 采用RNeasy kit（德国Qiagen公司产品）从石蜡切片中提取总RNA，采用随机引物法逆转录成cDNA，所有cDNA储存于-80℃备用。qRTPCRs试剂盒采用Power SYBR Green mix（美国ABI公司产品），荧光定量PCR仪为Chromo 4（德国BioRad公司产品），反应以GAPDH为内参基因，所有样本均设3个重复，以不加模版的孔作为阴性对照。数据分析采用改良delta delta Ct法，引物序列见表2。反应条件如下：95℃10min激活DNA聚合酶，94℃15s，56℃，30s，72℃，40s共40个循环。

表2 Real-time PCR实验所用引物

1.4 统计学处理 利用SPSS 18.0统计软件，采用卡方检验比较HNSCC淋巴结转移组与非转移组之间ALDH1、α-SMA的表达差异；采用Spearman相关分析比较ALDH1、α-SMA表达水平与病理分期间的相关性；Real-time PCR数据分别以无转移病例和转移病例原发灶靶基因mRNA表达水平为参照，采用改良delta delta Ct法比较mRNA表达水平，数据统计采用方差分析。

2 结果

2.1 免疫组化结果

2.1.1 α-SMA、ALDH1在HNSCC中的表达及分布 α-SMA在HNSCC中的表达水平变化较大，其表达阳性细胞主要位于肿瘤浸润的前缘，即肿瘤-正常组织交界处,胞质呈棕黄色，细胞质内出现背景清晰的纤细、长梭形棕黄及棕褐色颗粒，部分间质小血管亦可表达α-SMA，但不被计为阳性细胞。ALDH1在大多数HNSCC中均有不同程度的表达，其表达部位主要位于肿瘤细胞胞浆内，少数淋巴细胞及血管内皮细胞也可有低水平的表达。在有转移的HNSCC原发灶、转移的淋巴结以及病理为低分化的HNSCC中ALDH1、α-SMA阳性细胞较无转移者及高分化者明显增多，着色更深（图1，表3）。

图1 头颈部鳞癌（HNSCC）中ALDH1、α-SMA免疫组化双染结果[注:有转移的HNSCC原发灶中（A-2）ALDH1（红色）及α-SMA（棕色）的表达水平高于无转移病例（A-1）,α-SMA阳性细胞主要位于肿瘤-正常组织交界处；转移的淋巴结中（B-2）ALDH1及α-SMA的表达水平高于其原发灶（B-1）；低分化HNSCC中（C-2）ALDH1及α-SMA的表达水平高于高分化者（C-1）]

表3 ALDH1和α-SMA的免疫组化结果

2.1.2 α-SMA、ALDH1表达水平与肿瘤淋巴结转移的关系 见表4。

表4 ALDH1、α-SMA与淋巴结转移的关系（例）

由表4可见，在发生淋巴结转移的HNSCC中ALDH1、α-SMA的表达水平较无转移者显著增高，其中26例患者（26/36）同时高表达ALDH1和α-SMA（即ALDH1hingh、α-SMAhigh），显著高于无转移的患者（3/24），与之相对应的同时低表达ALDH1和α-SMA（即ALDH1low α-SMAlow）的患者比例在淋巴结转移组（6/ 36）则明显低于无转移组（11/24，P＜0.01），说明ALDH1和α-SMA的高表达与HNSCC淋巴结转移相关。

2.1.3 α-SMA、ALDH1表达水平与肿瘤病理分期的关系 见表5。

表5 ALDH1、α-SMA与肿瘤病理分期的关系（例）

由表5可见，高表达ALDH1的患者比例在高分化HNSCC中偏低（7/24），随着分化程度的降低其比例逐渐升高，在低分化的HNSCC中达到最高（14/16），其Spearman相关系数为0.562（P＜0.01）；α-SMA的表达情况与ALDH1类似，随着分化程度的降低其高表达比例逐渐升高，在低分化的HNSCC中表达最多，但差异无统计学意义（P＞0.05）。在低分化HNSCC中，α-SMA和ALDH1的表达具有高度协同性，高表达α-SMA的14例患者均同时高表达ALDH1，Spearman相关系数为0.596（P＜0.001），说明ALDH1和α-SMA表达与肿瘤病理分期之间存在正相关性。

2.2 Real-time PCR 荧光定量PCR结果显示在有转移的HNSCC患者中ALDH1和α-SMA的mNRA水平较无转移的患者平均分别升高了6.4倍和6.5倍；同时在转移的淋巴结中，ALDH1和α-SMA的mNRA水平较同一患者原发病灶平均分别升高了2.7倍和3.8倍，差异有统计学意义（图2）。

图2 Real-time PCR半定量分析HNSCC中ALDH1、α-SMA mRNA表达水平[注：A：有转移的HNSCC中ALDH1和α-SMA mNRA平均是无转移HNSCC的6.4倍和6.5倍（P＜0.01）；B：在转移的淋巴结中ALDH1和α-SMA mNRA平均是其原发灶的2.7倍和3.8倍（P＜0.01）]

3 讨论

自1971年Gabbiani和Majno通过电子显微镜对肉芽组织的观察，首先提出了肌纤维母细胞以来，肌纤维母细胞就一直是一个充满争议的问题[2-3]。目前认为肌纤维母细胞是一群同时具有平滑肌和纤维母细胞特征的细胞。肿瘤间质中的肌纤维母细胞主要来源于活化的具有平滑肌表型的纤维母细胞，故又称为癌/肿瘤相关纤维母细胞（cancer associated fibroblast，CAF），该细胞与肿瘤的发生、发展、浸润的过程有着密切的关系。肌纤维母细胞分化成熟的标志是表达特征性的α-SMA及一些平滑肌的标志如desmin、平滑肌肌球蛋白重链[4]。近年来，研究发现肌纤维母细胞可促进肿瘤的生长及肿瘤新生血管形成，并且能够促进肿瘤浸润和转移[5]。Horie等[6]在对肺癌进行研究中发现，肺癌组织中CAFs与正常成纤维细胞相比有一个显著的特点即高表达α-SMA，在体外将CAFs与肺癌细胞株共同培养，可显著增强肺癌细胞的侵袭能力。同样，在前列腺癌中，α-SMA阳性的肌纤维母细胞增多与肿瘤进展及不良预后相关。人为的抑制肌纤维母细胞的产生和分化可抑制肿瘤的生长[7]。本研究通过对60例HNSCC患者组织标本的研究发现，肿瘤间质中肌纤维母细胞数量与淋巴结转移与否密切相关（P＜0.05），在有转移的肿瘤中α-SMA的表达水平显著高于无转移组，且转移的淋巴结中α-SMA的表达也显著高于原发灶。此类表达α-SMA的细胞具有成纤维细胞的外观，多位于肿瘤浸润的前缘（即肿瘤-正常组织交界处），研究结果与陈珊珊等[8]在乳腺癌中的研究结论一致。

ALDH1是目前较为公认的肿瘤干细胞标志物，已在包括HNSCC在内的多种实体瘤中得到证实[9-13]，ALDH1+的肿瘤干细胞被认为是肿瘤复发、转移及治疗抵抗的主要原因之一。我们在此前的研究中也发现[1]，HNSCC细胞系中ALDH1+的肿瘤干细胞具有更强的侵袭能力，通过悬浮培养法可诱导HNSCC细胞发生不同程度的上皮-间质转换（Epithelial-Mesenchymal transition，EMT），发生EMT的HNSCC细胞高表达ALDH1，同时具有间质细胞的某些特性，更值得注意的是此类细胞同时高表达α-SMA，说明α-SMA与ALDH1的表达在HNSCC中可能存在某种关联。本文通过对组织蜡块染色及Real-time PCR发现，在HNSCC中α-SMA、ALDH1的表达存在高度一致性：在有转移的患者中两者的表达无论在蛋白水平还是mRNA水平均一致性增高，同样随着病理分级的增高，同时高表达α-SMA和ALDH1的比例也随之上升，各分级间差异有统计学意义。本研究中ALDH1的表达水平显示出与肿瘤分期及淋巴结转移间关系紧密；α-SMA的表达强弱则与淋巴结转移与否密切相关，虽然α-SMA在分化差的病例中表达也增高但无统计学意义，这可能与本研究样本量偏小有关，具体的机制还有待于进一步的研究证明。值得注意的是在无转移组中分别有5例ALDH1high和11例α-SMAhigh的病例出现淋巴结转移，而同时高表达α-SMA和ALDH1的仅有3例，因此，α-SMA与ALDH1单独或者组合用于检测HNSCC，将有助于预测肿瘤转移的可能性，为该类患者的治疗提供帮助。

总之，HNSCC的发生、发展是一个复杂的过程.与肿瘤细胞的干性、间质的状态及转移局部组织的特性等有密切的关系。本研究表明，联合检测 α-SMA、和ALDH1有助于判断疾病的恶性程度、浸润能力及转移潜能，可作为预测HNSCC预后的新指标。

[1] Chen C,Wei Y,Hummel M,et al．Evidence for epithelial-mesenchymal transition in cancer stem cells of head and neck squamous cell carcinoma[J]．PLoS One,2011,6(1):e16466．

[2] Gabbiani G,Ryan G B,Majne G．Presence of modified fibroblasts in granulation tissue and their possible role in wound contraction[J]．Experientia,1971,27(5):549-550．

[3] Majno G,Gabbiani G,Hirschel B J,et al．Contraction of granulation tissue in vitro:similarity to smooth muscle[J]．Science,1971, 173(996):548-550．

[4] Hisataki T,Itoh N,Suzuki K,et al．Modulation of phenotype of human prostatic stromal cells by transforming growth factor-betas[J]．Prostate,2004,58(2):174-182．

[5] Cao Y,Zhang Z L,Zhou M,et al．Pericyte coverage of differentiated vessels inside tumor vasculature is an independent unfavorable prognostic factor for patients with clear cell renal cell carcinoma[J]．Cancer,2013,119(2):313-324．

[6] Horie M,Saito A,Mikami Y,et al．Characterization of human lung cancer-associated fibroblasts in three-dimensionalin vitro co-culture model[J]．Biochemical and biophysical research communications,2012,158-163．

[7] Serini G,Bochaton-Piallat M L,Ropraz P,et al．The fibronectin domain ED-A is crucial for myofibroblastic phenotype induction by transforming growth factor-beta1[J]．J Cell Biol,1998,142(3): 873-881．

[8]陈珊珊,姚和瑞．α-SMA与ALDH 1在乳腺癌中的表达及临床意义[J]．岭南现代临床外科,2012,12(2):81-87．

[9] Ginestier C,Hur M H,Charafe-Jauffret E,et al．ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome[J]．Cell stem cell,2007,1(5): 555-567．

[10] Ma S,Chan K W,Lee T K,et al．Aldehyde dehydrogenase discriminates the CD133 liver cancer stem cell populations[J]．Molecular cancer research:MCR,2008,6(7):1146-1153．

[11] Jiang F,Qiu Q,Khanna A,et al:Aldehyde dehydrogenase 1 is a tumor stem cell-associated marker in lung cancer[J]．Molecular cancer research:MCR,2009,7(3):330-338．

[12] Huang E H,Hynes M J,Zhang T,et al．Aldehyde dehydrogenase 1 is a marker for normal and malignant human colonic stem cells(SC)and tracks SC overpopulation during colon tumorigenesis[J]．Cancer research,2009,69(8):3382-3389．

[13] Chen Y C,Chen Y W,Hsu H S,et al:Aldehyde dehydrogenase 1 is a putative marker for cancer stem cells in head and neck squamous cancer[J]．Biochemical and biophysical research communications,2009,385(3):307-313．

Expression of ALDH1 and α-SMA in head and neck squamous cell carcinoma and its clinicopathological significance

HNSCC α-SMA ALDH1

2012-12-28）

（本文编辑：田云鹏）

310022 杭州，浙江省肿瘤医院头颈外科（陈超、葛明华）；浙江大学医学院附属第一医院耳鼻咽喉科（魏燕）

陈超，E-mail：lancet2000@msn.com