补中益气汤对精索静脉曲张大鼠睾丸生精功能和一氧化氮的影响

安艳辉 商建伟 闫博 王旭昀 李铁 张耀圣

精索静脉曲张(varicocele, VC)是常见的男性泌尿生殖系统疾病，也是导致男性不育常见的原因之一，在男性不育症中占19%～41%[1]。世界卫生组织将VC列为男性不育的首位原因。目前对补中益气汤的药理研究证实，补中益气汤具有抗不育的药理作用。前期课题组运用补中益气汤治疗精索静脉曲张不育患者，疗效显著。一氧化氮(nitric oxide,NO)是内皮源性血管舒张因子的主要活性成分，是一种具有广泛生物活性的信使分子和毒性分子,参与多种生理和病理活动,其在VC不育的发病机制中占有重要地位。本研究通过观察比较各组大鼠睾丸组织形态学和腹主动脉血中NO含量变化,探讨补中益气汤对VC大鼠睾丸生精功能和腹主动脉血中NO浓度的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物及场所

SD成年雄性大鼠 30只，清洁级，体重210～240 g,购自北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司,动物合格证号：SCXK(京)2009-0017。实验场所为东直门医院实验室，环境温度19～23℃，相对湿度为20%～30%。

1.2 分组、动物模型的建立

动物购进后按随机数字表法分为正常组、模型组和治疗组，所有组别普通饲养(饲料由实验室供应)，定时喂养，自由饮水。动物购进分组后适应性喂养1周,观察无异常后开始造模。

模型的制备方法参照Saypol和Turner等人的方法[2]：用3.5%的水合氯醛按1 ml/100 g体重腹腔注射给药，麻醉成功后将大鼠固定于鼠板上，腹部备皮。在无菌操作下沿腹中线切1纵行开口，逐层分离，打开腹腔后先用浸有生理盐水的湿棉球将左侧结肠等腹腔内容物推向右侧，充分暴露左肾静脉、左肾上腺静脉、左侧精索静脉，从左肾上腺静脉入左肾静脉口处剥离左肾静脉段，在左肾静脉下放1根3/0丝线备用，把1个5 ml注射器针头平行放置于剥离的左肾静脉上，用带测微器的目镜测量左精索静脉直径，然后将针头和左肾静脉一起接扎，缓慢拔出针头，左肾静脉直径缩小至接扎前的1/2，造成左肾静脉的部分狭窄，最后寻找左精索内静脉与左髂总静脉之间的交通支，分离后用丝线接扎，还纳腹腔内容物，逐层缝合皮肤。模型组和治疗组按照上述方法造模，正常组仅打开腹腔，剥离暴露各静脉，不进行左肾静脉接扎。

1.3 药物治疗和动物模型成功的判定方法

动物造模1周后开始药物干预。治疗组用补中益气汤颗粒剂灌胃，补中益气汤颗粒剂药物组成：生黄芪30 g、人参9 g、白术10 g、柴胡6 g、升麻6 g、当归15 g、陈皮15 g、炙甘草9 g，在东直门医院免煎颗粒药房按照以上剂量制备成颗粒剂，用药前用双蒸水将药物稀释成浓度为1.4 g/ml的药液，按1 ml/100 g体重灌胃，每日1次，连续灌胃45天(大鼠的平均生精周期为12.6天)。正常组和模型组均按1 ml/100 g体重灌胃双蒸水每日1次，连续灌胃45天，不进行其他干预。各组均给与普食饲养，自由饮水。

模型组和药物治疗组分别于药物治疗45天后，用3.5%水合氯醛按1 ml/100 g进行腹腔注射，待麻醉成功后，打开腹腔，用带测微器的目镜测量大鼠左精索内静脉直径,观察其曲张程度, 若左侧精索内静脉扩张，双侧肾脏都未出现萎缩，并且双侧肾脏质量无明显差异,判定手术造模成功。

1.4 NO检测、睾丸病理切片及Johnson’s评分方法

各组大鼠药物治疗45天后，麻醉条件下打开腹腔，抽取腹主动脉血2 ml后, 将血样迅速低温离心，分离血清，把分离后血清放置60℃冰箱冷存，交由北京康源瑞德生物有限公司采用硝酸还原酶法检测NO，按试剂盒操作进行。取双侧睾丸组织固定于Bouin’s溶液中24小时,在置于70%乙醇24小时，随后以石蜡包埋。5 μm厚切片，脱蜡，以苏木精-伊红(HE)染色。睾丸病理切片由东直门医院病理科制备，观察各组睾丸生精上皮变化，并作Johnson’s评分[3]，评分共分10个等级，积分越高，精子发生越好，积分越低，精子发生障碍越严重。

评分标准：10分：完好的精子发生和许多精子，生精细胞层次规则；9分：有很多精子，但生精细胞排列紊乱，管腔内有脱落的生精细胞；8分：切片中仅发现少数精子；7分：无精子但有许多精子细胞；6分：无精子，仅少许精子细胞；5分：无精子及精子细胞，但有许多精母细胞；4分：极少数精母细胞，无精子及精子细胞；3分：仅有精原细胞；2分：仅有支持细胞；1分：完全透明变形。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠腹主动脉血中NO含量

正常组中腹主动脉血中NO含量为(10.2174±3.6164)μmol/L，模型组中腹主动脉血中NO含量为(17.8035±2.8055)μmol/L，治疗组中腹主动脉血中NO含量为(16.3285±3.6164)μmol/L。正常组与模型组血清NO含量采用采用配对t检验进行比较，差异有统计学意义(P<0.05)；模型组与治疗组血清NO含量采用采用配对t检验进行比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠腹主动脉血中NO含量

2.2 睾丸病理切片结果

正常组中：大鼠睾丸曲细精管排列规则、紧密有序；曲细精管由基膜、肌样细胞与胶原纤维交替层所组成的界膜包绕；曲细精管内含有各级生精细胞及支持细胞(Sertoli细胞)。基底至管腔，依次有精原细胞、精母细胞、精子细胞及大量精子，亦见支持细胞，其基部紧贴基膜，顶部伸达管腔；曲细精管间的间质为疏松结缔组织，未见著变(见图1、图2)。模型组中：大鼠睾丸局灶性或片状曲细精管萎缩；各级生精细胞排列疏松紊乱，管内生精细胞数量明显减少，生精细胞脱落于管腔中，精子发生停滞；少数病变严重者，曲细精管内仅有支持细胞，管腔伴钙化；间质有水肿，病变严重者，间质细胞增生(见图3、图4)。治疗组中：大鼠睾丸组织散在个别曲细精管内生精细胞减少，不见仅有支持细胞的曲细精管，病变范围及程度分别较图3和图4明显减轻(见图5、图6)。

图1 灌胃45天后，正常组大鼠左侧睾丸组织(HE染色，×400)

图2 灌胃45天后，正常组大鼠右侧睾丸组织(HE染色，×400)

图3 灌胃45天后，模型组大鼠右侧睾丸组织(HE染色，×400)

图4 灌胃45天后，模型组大鼠左侧睾丸组织(HE染色，×400)

图5 灌胃45天后，治疗组大鼠左侧睾丸组织(HE染色，×400)

图6 灌胃45天后，治疗组大鼠右侧睾丸组织(HE染色，×400)

2.3 Johnson’s评分结果

模型组大鼠睾丸组织的Johnson评分结果为(6.81±1.15)，与正常组评分结果(10.19±0.31)相比，明显降低，进行配对t检验，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，治疗组Johnson评分为(8.73±0.28)，明显升高，进行配对t检验，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

补中益气汤原载于金代名医李东垣《脾胃论》，由黄芪、人参、白术、陈皮、升麻、柴胡、当归、炙甘草组成，具有调补脾胃、补中益气、升阳举陷之功。补中益气汤含有多种人体所需物质，如黄芪多糖，果糖，氨基酸，维生素B及锌，尤其是果糖及锌对精子活动极其重要。Amano等[4]证实，补中益气汤在体外可以有效提高精子的运动能力，但不影响精子的荧光参数。Furuya等[5]基于传统辨证将补中益气汤用于自发性男性不育，发现补中益气汤可以有效提升精子数量和运动能力，升高精液可溶性Fas 水平，并指出中药应用需要辨证论治。课题组前期应用补中益气汤治疗VC不育患者，疗效显著。

Turner等[6]研究发现，人类和大鼠左肾静脉受压后，其脉管反应是出现左侧精索内静脉曲张，并重新建立相似的侧支循环，血液都回流到髂静脉末端。人类和大鼠左侧精索静脉回流受阻后反应的相似性，为课题组用大鼠模型研究VC的病理生理提供了理论上的可行性。在本实验研究中模型组大鼠与正常组大鼠相比，睾丸的生精细胞结构层次紊乱、精子数量减少，Johnson’s评分结果也表明模型组大鼠睾丸生精功能出现明显损害，这与文献报道的情况相似，这表明VC损害了大鼠睾丸的生精功能。治疗组与模型组相比，大鼠睾丸生精功能损害减轻，Johnson’s评分结果也表明治疗组大鼠睾丸生精功损害程度较模型组轻，这说明补中益气汤能够减轻VC对大鼠睾丸生精功能的损害。

NO是一种具有广泛生物学活性的信使分子和毒性分子[7]。有体外实验表明：NO对精子功能的影响具有双重性，高浓度的NO损害睾丸的生精功能，而低浓度的NO则能提高精子的活动度。不难发现NO在精索静脉曲张不育研究中占有重要地位。刘蕾等[8]通过研究VC大鼠睾丸组织中TNF-α和NO含量的变化，认为VC时TNF升高使得精子细胞生成、维持、成熟受到损伤，降低生育能力；VC时过量产生的NO损伤睾丸组织细胞，进而影响生精及精子成熟过程；TNF-α和NO之间相互作用，诱发睾丸组织免疫反应，同样会损伤睾丸组织。孙自学等[9]通过实验研究发现：精索静脉曲张模型组睾丸组织内NO合成酶活性增强，NO合成增加，过量的NO抑制了精子ATP的合成，损害精子功能。本研究中模型组和治疗组中NO含量显著高于正常组(P<0.01)，模型组NO含量明显高于正常组，这与文献报道结果相一致；但是模型组和治疗组中NO含量差异无显著性(P>0.05)，这与部分文献报道结果不同，课题组认为出现这种情况的原因有：(1)研究部位不同所引起,以往研究中多检测人精索静脉血液或者大鼠睾丸组织中NO含量，而本研究检测的是大鼠腹主动脉血液中NO含量；(2)观察周期不同所引起，本研观察周期为45天，与部分文献报道相比周期较短；(3)VC大鼠腹主动脉血中NO含量与其睾丸生精功能无相关性。

[1] Naughton CK，Nangia AK, Agarwal A. Pathophysiology of varicoceles in male infertility [J].Hum Reprod Update,2001,7(5):473-481.

[2] Turner TT. The study of varicocele through the use of animal modeles[J]. Hum Repord Update,2001,7(1):78-84.

[3] 杨庆.精索静脉曲张大鼠模型的建立及其不育发生机理的实验研究[D].北京:中国协和医科大学研究生院，2008.

[4] Amano T, Hirata A, Namiki M. Effects of Chinese herbal medicine on sperm motility and fluorescence spectra parameters[J]. Arch Androl.1996，37(3)：219-224.

[5] Furuya Y, Akashi T,Fuse H. Treatment of traditional Chinese medicine for idiopathic male infertility[J]. Hinyokika Kiyo.2004，50(8)：545-548.

[6] Turner TT, Howards SS. The venous antomy of experimental left varicocele：Comparison with naturally occurring left varicocele in Human[J].Fertil Steril, 1994, 62(4):869-875.

[7] 许苑，徐庆阳，杨本海，等.一氧化氮、一氧化氮合酶与伴精索静脉曲张不育患者精液参数的关系[J].中华男科学杂志，2008，14(5)：415.

[8] 刘蕾，王淑秋，赵玉珍，等.实验性精索静脉曲张大鼠睾丸组织TNF-α和NO含量的变化[J].中国病理生理杂志，2005,21(10)：2054-2056.

[9] 孙自学，蒋平，王春霞.益肾通络颗粒对实验性精索静脉曲张大鼠睾丸组织SOD、MDA、NO、ATP的影响[J].中国中医基础医学杂志，2008,14(9)：661.