传统风鸭中蛋白分解菌株的筛选及对鸭肉香肠品质特性的影响

王小兰，于 海，崔保威，王 敏，谷成业，汪志君*

(扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州 225127)

传统风鸭中蛋白分解菌株的筛选及对鸭肉香肠品质特性的影响

王小兰，于 海，崔保威，王 敏，谷成业，汪志君*

(扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州 225127)

从传统风鸭中筛选出优质蛋白分解菌株C94并应用到鸭肉香肠中，测定香肠在成熟过程中的理化指标。通过自然发酵的对照组(CK)和添加发酵剂的实验组进行比较。结果表明：实验组的aw值、pH值迅速降低，天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、赖氨酸等含量均有一定程度的增加，其中赖氨酸含量为135.68mg/100g，而CK组仅为37.32mg/100g。采用顶空固相微萃取(SPME)和气质联用(GC-MS)的方法对鸭肉香肠中挥发性风味化合物的种类和相对含量进行分析，实验组共检测出69种风味物质，其中醛类23种、烷烃类15种、醇类7种、酸类3种、酯类6种、酮类4种等。

风鸭；蛋白质；筛选；电泳；香肠；风味

发酵香肠主要是利用微生物的发酵作用，使其产生特殊风味、色泽和质地[1]。同时，鸭肉含水量为50%～60%，蛋白质含量比畜肉含量高约18%，鸭肉蛋白的组成中，氨基酸含量甚为丰富，利用鸭肉为原料生产出的香肠具有味道鲜美、易于吸收、携带方便、保存时间长等优点[2]。发酵香肠的规模化生产，关键是要对微生物发酵剂的研究和探索[3]，传统发酵肉制品加工周期较长、加工过程难以控制，通过添加人工发酵剂能够缩短生产周期，控制产品质量、提高产品质量稳定性。因此，微生物发酵剂是发酵香肠生产的关键因素之一[4]，本实验通过SDS-PAGE法从传统风鸭中筛选出优质蛋白分解菌株，并接种到鸭肉香肠中，通过自然发酵的对照组(CK组)和添加发酵剂的实验组进行比较，测定鸭肉香肠理化指标的变化，具体分析香肠中风味化合物的种类和相对含量，初步探讨葡萄球菌对香肠风味物质产生的促进作用，以期为充分利用我国丰富的菌种资源，改善发酵肉制品品质，开发具有我国自主知识产权的肉品发酵剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

风鸭，购于扬州农贸市场。

蛋白胨、牛肉膏为生化纯，SDS、浓硫酸、硼酸、甲基红、溴甲酚绿、碘化汞、碘化钾、硫酸铵、磺基水杨酸、纳氏试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

eps300电泳仪 上海Unico公司；5804R高速冷冻离心机 北京艾泽信科技有限公司；KDN-04A蛋白质测定仪 上海贝特仪电设备厂；WFJ2000分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司；复合式75μm Car/PDMS萃取头美国Supelco公司；Trace气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)美国Finnigan公司；755S紫外-可见分光光度计 上海棱光技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分离纯化

在无菌操作条件下，取风鸭深部(距表面2.5cm处)肉，切碎，置于MSA液体培养基中，振荡，30℃培养48h，分离纯化，直至纯菌落，挑取单个菌落革兰氏染色，细胞形态镜检，革兰氏阳性菌保存待用。

1.3.2 菌株全细胞悬液的制备

参照Annalisa等[5]的方法。

1.3.3 肌浆蛋白的提取

称取肉样10g，充分粉碎后按料液比1:10(m/V)加入0.03mol/L pH6.5的磷酸缓冲液，4℃高速均质后，同温度下12000r/min离心20min，取上清液用8～1.5kD透析袋4℃过夜，即为肌浆蛋白[6]。

1.3.4 肌原纤维蛋白的提取

称取肉样10g，充分粉碎后按料液比1:10(m/V)加入0.03mol/L pH6.5的磷酸缓冲液，4℃高速均质后，同温度下12000r/min离心20min，弃上清液，沉淀再以1:10加入0.03mol/L，pH6.5的磷酸缓冲液，4℃、10000r/min离心20min。重复上述操作3次，然后沉淀按1:4比例加入0.1mol/L、pH6.5(含0.7mol/L KI和0.02% NaN3)的磷酸缓冲液，4℃匀浆4min，再于12000r/min离心20min，取上清液4℃透析过夜，即为肌原纤维蛋白[7]。

1.3.5 蛋白提取物接种菌株全细胞悬液

分别将100μL菌株全细胞悬液接种到400μL肌浆蛋白和肌原纤维蛋白(以下简称为蛋白提取物)中，对照组加入100μL 0.02mol/L pH 6.5磷酸盐缓冲液，37℃培养箱中发酵5～6d。

1.3.6 SDS-PAGE法检测菌株对蛋白提取物的降解能力

参照汪家政等[8]的方法，并加以改进。浓缩胶为4%，肌浆蛋白分离胶为15%，肌原纤维蛋白分离胶为12%。

上样：将两种蛋白质样品质量浓度调至1mg/mL，然后与5×样品缓冲液(含60mmol/L Tris、2% SDS、14.4mmol/L巯基乙醇、25%甘油，用4mol/L盐酸调pH值至6.8，加入0.1%溴酚蓝)按体积比4:1混合。上样前样品煮沸10min，中分子质量蛋白质Marker煮沸5min，宽分子质量蛋白质Marker 40℃温水中放置10min，样品及蛋白质Marker上样量均为10μL。

电泳：起始电压80V，样品进入分离胶后电压调至150V，待溴酚蓝到达距底线1.5cm左右时，停止电泳。

染色：加入考马斯亮蓝R-250染色液(甲醇、冰醋酸、水体积比45:10:45，并加入0.2%考马斯亮蓝R-250)，混合染色40min。

脱色：用清水清洗凝胶，加脱色液(甲醇、冰醋酸、水体积比5:5:40)，于脱色摇床上反复多次脱色。

1.3.7 所筛选菌株的安全性检测

1.3.7.1 溶血性实验

在普通营养琼脂培养基中加入猪血混匀，趁热倾倒平皿，冷却保藏，将被检菌株划线接种于血琼脂平板中，37℃倒置培养48h后，取出，观察其菌落周围是否产生溶血圈[9]。

1.3.7.2 动物实验

样品前处理：将所要检验的菌株活化两代，用无菌生理盐水调节菌体浓度106CFU/mL。

方法：用无菌注射器吸取菌液1mL注射于小鼠腹腔，观察小鼠饮欲、食欲、活动及死亡情况，实验期为2周。

1.3.8 水分活度的测定

参照GB/T 9695.12—1988《肉与肉制品水分活度测定》进行。称取2g肉样，绞碎，用精密水分活度测定仪进行测定。

1.3.9 pH值的测定

参照GB 9695.5—1988《肉与肉制品pH测定》进行。取5g样品，用研钵研碎，加入50mL中性的蒸馏水，振荡30min，过滤，滤液用pH计测定。

1.3.10 游离氨基酸含量的测定

取鸭肉香肠10g，加入8%的磺基水杨酸10mL，高速均质机均质后，4℃、10000r/min离心20min，取上清液过滤，4℃、20000r/min离心15min，取上清液于氨基酸自动分析仪检测。

1.3.11 挥发性风味化合物的提取

分别取实验组和对照组发酵后期的肉样，密封后于—20℃保藏备用。测试前将冷冻鸭肉香肠切成薄片，迅速置于液氮罐中，0.5h后取出磨成粉末，准确称取4.0g放入15mL萃取瓶，盖上盖子，密封备用。

萃取头第一次使用时在气相色谱进样口老化2h，老化温度为250℃，载气体积流量为0.8mL/min，分流比为50:1。将复合式75μm Car/PDMS萃取头插入密封的样品瓶，推出萃取头，使其暴露在瓶内样品上部的顶空中，60℃萃取90min，然后将萃取头插入气相色谱进样口于250℃解吸2min，抽回纤维头后拔出萃取头，同时启动仪器采集数据[10]。

1.3.12 挥发性风味物质的鉴定

用气质联用仪(GC-MS)进行风味物质鉴定。气相色谱条件：毛细管色谱柱为DB-5MS，长60m，内径0.32mm，涂层厚1μm。载气为He，不分流，恒流12mL/min；进样口温度为250℃；进样口温度250℃，解析2min。

程序升温：起始温度40℃保持1min，以50℃/min升至130℃，80℃/min升至200℃，12℃/min升至250℃，保持7min，GC与MS接口温度为250℃。

质谱条件：离子源为EI源，温度为200℃，接口温度为250℃，检测器电压350V，发射电流150μA，扫描范围33～500u。

1.3.13 挥发性风味物质的定性和定量

定性：化合物经计算机检索，与NIST library(170 k compounds)相匹配，相似指数(SI)800以上为确认化合物(最大值为1000)。

定量：相对百分含量按峰面积归一化计算。用SAS9.1.3软件对实验数据进行分析[11]。

2 结果与分析

2.1 风鸭中蛋白分解菌株的分离与纯化

从自然发酵风鸭中分离纯化得到157株单菌株，经革兰氏染色和显微镜观察，筛选出革兰氏阳性的纯菌株59株，不产生溶血圈、血浆凝固酶阴性的菌株50株，注射菌液的实验小鼠无不良反应，表明所筛选葡萄球菌为非致病性菌株，可以作为肉制品发酵剂的备选菌株。

2.2 风鸭中蛋白降解菌株的初筛

将菌株全细胞悬液分别接种到肌浆蛋白和肌原纤维蛋白中，对每个发酵样进行SDS-PAGE分析，筛选出蛋白降解能力强的菌株，初步筛选出菌株C1、C2、C22、C41、C82、C86、C94和C116对肌浆蛋白和肌原纤维蛋白均有较强的降解能力。

2.3 风鸭中蛋白降解菌株的复筛

由图1可知，将不同的菌株接种到肌浆蛋白提取物中，37℃发酵5～6d后，对照组和实验组样品的蛋白质片段均发生一定程度的降解。CK组分子质量大于45kD的蛋白质降解明显，但20kD左右的低分子质量蛋白质降解不明显；接种C82的实验组31kD左右的蛋白质片段降解明显，40kD附近的条带颜色加深，说明该蛋白浓度增加；接种C86的实验组20kD左右的低分子质量蛋白质降解程度比C82实验组加剧；接种C22的肌浆蛋白降解相对不明显；接种C41、C116和C1的肌浆蛋白降解情况相似。接种C41的肌浆蛋白分子质量在14.4～20kD之间有一条带降解不明显；接种C94的肌浆蛋白降解情况最为明显，各分子质量蛋白均有不同程度的降解，分子质量大于45kD的蛋白几乎完全降解，20kD左右的蛋白片段降解成14.4kD左右的小分子片段，31kD附近蛋白条带颜色变浅。

图1 接种不同菌株的肌浆蛋白SDS-PAGE电泳图Fig.1 SDS-PAGE of sarcoplasmic protein hydrolyzed by Staphylococcus strains

图2 不同菌株处理肌原纤维蛋白SDS-PAGE电泳图Fig.2 SDS-PAGE of myofibrillar protein hydrolyzed by Staphylococcus strains

由图2可知，将不同的菌株接种到肌原纤维蛋白提取物中，37℃发酵5～6d，和CK组相比，接种C82的肌原纤维蛋白分子质量为20kD的条带发生降解；接种C41、C116和C1的蛋白降解情况相似，其分子质量在40kD以下的蛋白条带均发生明显的降解，分子质量在50kD左右的蛋白质片段几乎消失；同样接种C94的肌原纤维蛋白降解情况最为明显，大于120kD的大分子蛋白质片段明显减弱，生成了100～120kD之间的小分子片段，这是其他菌株所没有的作用效果，50kD处的蛋白条带也发生明显的降解，40kD处的条带颜色明显减弱。综合菌株对肌浆和肌原纤维蛋白的降解情况，最终选择菌株C94作为香肠发酵剂的目标菌株。

2.4 鸭肉发酵香肠的理化成分分析

2.4.1 香肠成熟过程中水分活度的变化

由图3可知，水分活度在发酵过程中呈下降趋势。实验组和CK组最初水分活度值在0.9左右，CK组水分活度一直处于平缓下降趋势，发酵13d后实验组水分活度下降速度加快，发酵结束后，实验组水分活度降为0.8190，CK组为0.8595，实验组水分活度值显著低于CK组(P＜0.05)，低水分活度的环境能够更加有效抑制腐败微生物的生长，对香肠的保藏起到较好的作用。

图3 鸭肉香肠生产过程中水分活度变化Fig.3 Change of water activity during the fermentation process of duck sausage

2.4.2 香肠成熟过程中pH值的变化

图4 鸭肉香肠生产过程中pH值的变化Fig.4 Change of pH during the fermentation process of duck sausage

由图4可知，随着发酵期的延长，鸭肉香肠的pH值逐渐下降，且pH值的降低主要发生在发酵前期(0～9d)，尤其前3d的下降速率最快，到发酵后期(15～21d)pH值的下降趋于平缓，发酵结束时，实验组pH值显著低于CK组(P＜0.05)，实验组发酵20d后，pH值略有回升主要是因为在微生物的作用下，蛋白质水解产生的氨等碱性缓冲物质累积引起的。

2.4.3 香肠成熟过程中游离氨基酸含量的变化

图5 鸭肉香肠发酵末期游离氨基酸的含量Fig.5 Amounts of free amino acids in fermented duck sausage

肌浆蛋白和肌原纤维蛋白先被降解成多肽，然后多肽在肽酶作用下降解成小肽，小肽在氨肽酶的作用下最终形成游离氨基酸。游离氨基酸是香肠重要的滋味物质，而且某些氨基酸可以参与氨基酸代谢生成支链的醛，是香肠重要的风味物质，鸭肉香肠发酵成熟后期实验组和对照组游离氨基酸的含量见图5。香肠发酵结束后，实验组游离氨基酸总量与CK组相比显著增加(P＜0.05)，实验组的游离氨基酸总量为3375.06mg/100g，CK组为3024.91mg/100g，其中实验组胱氨酸(Cys)含量降低不显著(P＞0.05)，天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、酪氨酸(Tyr)以及赖氨酸(Lys)这4种氨基酸的含量显著高于对照组(P＜0.05)，甘氨酸(Gly)含量增加不显著(P＞0.05)，从占总游离氨基酸的相对含量来看，比CK组增加比例分别为天冬氨酸(0.93%)、谷氨酸(1.22%)、酪氨酸(0.07%)、赖氨酸(2.79%)。

2.4.4 香肠成熟过程中挥发性风味物质分析

发酵香肠最终风味的形成是众多风味物质综合作用的结果，如蛋白质降解生成的氨基酸、微生物代谢和脂肪氧化生成的芳香化合物。通过固相微萃取和气质联用(SPME-GC/MS)来分析CK组和实验组香肠中挥发性风味化合物，具体分析结果见表1。

表1 鸭肉香肠中挥发性风味物质的相对含量Table1 Relative contents of volatile flavor compounds in fermented duck sausage

续表1

续表1

由表1可知，添加发酵剂的实验组共检测出69种风味物质，包括醛类23种、烷烃类15种、醇类7种、酸类3种、酯类6种、酮类4种、醚类1种和其他10种；CK组共检测出68种风味物质，包括醛类20种、烷烃类14种、醇类8种、酸类9种、酯类7种、酮类1种、醚类1种和其他8种。其中实验组醛类物质相对含量最高，为68.12%，是重要的风味贡献物质，主要为壬醛、2,4-癸二烯醛、辛醛；实验组的酯类物质相对含量明显增加，主要为10-甲基-8-十四烯乙酯和异胆酸乙酯。Berdague等[12]研究表明一些酯类物质如丙酸乙酯、醋酸丙酯、丁酸乙酯来自碳水化合物的代谢发酵过程；由此可知，葡萄球菌C94一定程度上促进酮类、醇类、烷烃类、醛类和其他一些氨基酸链的产生，同时酸类物质明显减少。

酮类一般由美拉德反应、酯类降解、氧化或进一步反应生成。由表1可知，酮类物质在挥发性风味物质中所占的相对含量不到2%，因此酮类物质对香肠最后的风味影响不大[13]。醇类物质的产生一方面来自香肠自身化学降解[14]，一方面由于微生物的代谢产生。酯类物质是发酵香肠典型风味所必需的，它们多带有芳香味[15]，酯类的形成通常需要一个复杂的反应链，它们来自微生物作用下醇类和酸类的酯化反应。

3 结 论

葡萄球菌具有硝酸盐还原酶、过氧化氢酶以及蛋白酶和脂肪酶活性，对发酵香肠的色泽、风味都起到重要作用，本实验从传统风鸭中分离、纯化单菌落，再初步筛选出革兰氏阳性、安全无毒的菌株50株，采用SDSPAGE凝胶电泳法测定上述菌株对肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的降解情况，最终筛选到蛋白降解能力最强的菌株C94，将菌株C94接种到鸭肉香肠中，实验结果表明葡萄球菌C94迅速降低香肠的pH值、aw值，更好的保障鸭肉香肠的安全性，使得葡萄球菌成为其中的优势菌。实验组中氨基酸总量显著增加(P＜0.05)，这是因为葡萄球菌具有蛋白酶活性，将鸭肉中的蛋白质降解产生大量游离氨基酸，氨基酸又进一步降解为支链的醛、醇、酮等，促进风味物质的形成，这与实验组检测出的丰富的风味物质相一致，实验组检测出69种风味物质，其中醛类占68.12%。因此，在香肠中接种蛋白降解菌株C94对香肠品质提高起到非常重要的作用。

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Screening of Protein Hydrolysis Strain from Air-dried Duck and Its Application in Fermented Duck Sausage

WANG Xiao-lan，YU Hai，CUI Bao-wei，WANG Min，GU Cheng-ye，WANG Zhi-jun*
(College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China)

In this study, the strain C94with the function of protein hydrolysis was screened from traditional air-dried duck and applied in duck sausage. The physical and chemical indicators of the sausage during the process of maturation were determined. Compared with naturally fermented group (CK) with Saprophytic staphylococcus fermented duck sausages, the awand pH of C94fermented duck sausages revealed a rapid decrease, however, the amount of aspartic acid, glutamic acid, tyrosine and lysine revealed an obvious increase. The amount of lysine was up to 135.68 mg/100 g in C94fermented duck sausages, and was only 37.32 mg/100 g in the CK group. The types and amounts of volatile compounds in Saprophytic staphylococcus fermented duck sausages was analyzed by solid phase microwextractiongas chromatography (SPME/GC-MS). Totally 69 kinds of flavor substances were identified in Saprophytic staphylococcus fermented duck sausages, which included 23 kinds of aldehydes, 15 kinds of hydrocarbons,7 kinds of alcohols,3 kinds of acids,6 kinds of esters,4 kinds of ketones and others.

air-dried duck；protein；screen；electrophoresis；sausage；flavor

TS251.5

A

1002-6630(2013)03-0222-06

2011-10-31

江苏省科技支撑计划项目(BE2009367)；江苏省自然科学基金项目(BK2008212)；扬州大学“新世纪人才工程”项目

王小兰(1987—)，女，硕士研究生，研究方向为食品微生物资源开发利用。E-mail：wangxiaolan1211@163.com

*通信作者：汪志君(1949—)，男，教授，博士，研究方向为食品微生物资源开发利用及肉制品加工。E-mail：zjwang@yzu.edu.cn