麝香草酚对食品常见污染菌的抑菌作用

王 娣，许 晖，钱时权，曹珂珂，任茂生，田长城

(蚌埠学院生物与食品工程系，安徽 蚌埠 233030)

麝香草酚对食品常见污染菌的抑菌作用

王 娣，许 晖，钱时权，曹珂珂，任茂生，田长城

(蚌埠学院生物与食品工程系，安徽 蚌埠 233030)

为阐明麝香草酚的抑菌作用，采用滤纸片法、牛津杯法和扩散法(打孔法)等体外抑菌实验对食品中常见的10种污染菌进行抑菌作用研究，并测定麝香草酚对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热乳酸链球菌、异常汉逊氏酵母、酿酒酵母、黑曲霉、黄曲霉的最低抑菌质量浓度。结果表明：麝香草酚抑菌谱广，对食品中常见污染菌有一定抑制作用，其中对细菌的抑菌效果最好。麝香草酚对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的最低抑菌质量浓度分别为10、20、20μg/mL。

麝香草酚；抑菌作用；滤纸片法；牛津杯法；扩散法

麝香草酚(thymol)，别名麝香草脑、百里酚，片状结晶，极易溶于乙醇、乙醚、醋酸、氯仿和苯中。天然存在于唇形科植物百里香属植物中，有百里香属植物的辛香和草香香气，是植物挥发油的主要成分(含50%左右)[1-2]，可用酚钠盐法从植物挥发油中单离出来，再经干燥、减压蒸馏即得产品。百里香属植物是一种颇具开发价值的多用途植物，可以作为天然调味品、药用植物和蜜源植物等[3-5]。我国主要分布于甘肃、内蒙古等地区[6]。国内外学者对麝香草酚活性进行了不少研究。Chu等[7]用质量浓度30mg/L蒸汽麝香草酚对甜樱桃进行熏蒸处理，可以有效抑制灰霉病和褐腐病，贮藏期间处理的甜樱桃只有0.5%的灰霉病。Liu Weitang等[8]研究表明用2～4mg/L质量浓度的麝香草酚对杏和李熏蒸处理可显著降低烂果率，而且对水果组织不产生任何影响。这说明麝香草酚具有一定抑菌防腐活性。本实验采用滤纸片法、牛津杯法以及扩散法研究麝香草酚对食品中常见污染菌的抑制作用，为麝香草酚作为食品防腐剂的开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与菌株

1.1.1 麝香草酚

麝香草酚(C10H14O，含量＞98%，分析纯) 天津博迪化工股份有限公司。

1.1.2 供试菌种

细菌：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)GIM 1.55、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GIM 1.131、大肠杆菌(Escherichia coli)GIM 1.154、变形杆菌(Proteus vulgaris)GIM 1.192、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)GIM 1.189、嗜热乳酸链球菌(Streptococus thermophilus)GIM 1.83；酵母：异常汉逊氏酵母(Hansenula anomala)GIM 2.18、酿酒酵母(Saccharmucescerevisiae)GIM 2.34、霉菌：黑曲霉(Aspergillus niger)GIM 3.24；黄曲霉(Aspergillus fl avus)GIM 3.18；以上菌种购于广州微生物研究所。

1.1.3 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基(BPA)：培养金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)采用牛肉膏蛋白胨培养基(BPA)；变形杆菌(Proteus vulgaris)用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(BPAE)，添加95%的酒精5mL/100mL。

乳酸细菌培养基(MRS琼脂培养基)：培养保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜热乳酸链球菌(Streptococus thermophilus)采用MRS琼脂培养基。

马铃薯汁葡萄糖琼脂培养基(PDA)：培养异常汉逊氏酵母(Hansenula anomala)、酿酒酵母(Sacchromuces cerevislac)、黑曲霉(Aspergillus niger)、黄曲霉(Aspergillus fl avus)采用马铃薯汁葡萄糖琼脂培养基(PDA)。

1.1.4 仪器与设备

LRH-150-Ⅱ智能生化培养箱、SW-CJ-2F超净工作台 上海一恒科学仪器有限公司；LDZX-40BI高压灭菌锅 北京京仪东方科技有限公司；LX41多功能显微镜上海富众生物科学有限公司。

1.2 方法

1.2.1 供试菌种的准备

将供试菌种划线接入相应的试管斜面培养基上，细菌于37℃恒温培养箱中培养24h，酵母于28℃恒温培养箱中培养48h，霉菌于28℃恒温培养箱中培养5d，4℃冰箱中冷藏备用。

供试菌株菌悬浮液的制备：分别用接种环挑取少许细菌、酵母菌和霉菌孢子于装有玻璃珠和10mL无菌生理盐水的三角瓶中，振荡，采用活菌计数法测定菌数[9]，制成菌体或孢子浓度为106～107CFU/mL的均匀菌悬浮液或孢子悬液。

1.2.2 滤纸片法测定抑菌效果

不同质量浓度的麝香草酚配制：麝香草酚加少许吐温-80增溶[10]，再加适量无菌水超声乳化、定容，配制成500、800、1000μg/mL不同质量浓度(吐温-80含量不超过0.5%)。以0.5%的吐温-80作为对照。

根据王忠民等[11]方法并加以改进。取灭菌后的滤纸圆片(d=6mm)，分别置于不同质量浓度的麝香草酚中浸泡10min，沥去多余液体，置于已用0.1mL菌悬液涂布均匀的培养皿中，每个菌种做3次平行。细菌恒温培养24h，酵母培养48h，霉菌培养5d，观察有无抑菌作用。

1.2.3 牛津杯法测定抑菌效果

根据武忠伟等[12]实验方法并加以改进。取灭菌烘干的牛津杯(外径8mm、内径6mm、高10mm)置于已用0.1mL菌悬液涂布均匀的培养皿中，用无菌微量移液器分别注入200μL不同质量浓度的麝香草酚(500、800、1000μg/mL)，每种菌做3个平行。培养温度和时间同1.2.2节，观察有无抑菌作用。

1.2.4 扩散法(打孔法)测定抑菌效果

根据李建慧等[13]方法并加以改进。用灭过菌的打孔器(孔径6mm)在用0.1mL菌悬液涂布均匀的培养皿中十字对称打4个孔，用无菌微量移液器分别加入100μL不同质量浓度的麝香草酚(500、800、1000μg/mL)，每种菌做3个平行。培养温度和时间同1.2.2节，观察有无抑菌作用。

重复验证检验：在定性检验的基础上，选取对麝香草酚敏感的3种细菌(金黄色葡萄球菌S. aureus、枯草芽孢杆菌B. subtilis、大肠杆菌E. coli)做重复验证检验，观测其抑菌圈直径大小，以0.1%的苯甲酸钠作为阳性对照。

1.2.5 最低抑菌质量浓度(MIC)的测定[13]

用灭过菌的打孔器(孔径6mm)在培养皿(0.1mL菌悬液涂布均匀)中十字对称打4个孔，分别加入2.5～320μg/mL系列质量浓度的麝香草酚100μL，以0.5%的吐温-80作为对照，培养、观察，得到最低抑菌质量浓度(MIC)。

2 结果与分析

2.1 滤纸片法测定抑菌结果由表1、图1可知，麝香草酚对这10种食品中常见污染菌都有一定抑制作用。随着麝香草酚质量浓度的增加，抑菌作用在不断增强。麝香草酚质量浓度为1000μg/mL时，对细菌中的大肠杆菌抑菌作用最明显，其次是金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌；对酵母菌中的酿酒酵母抑菌作用要大于异常汉逊氏酵母；对霉菌中的黑曲霉抑菌作用稍强一些。

表1 滤纸片法测定不同质量浓度麝香草酚的抑菌效果Table1 Antimicrobial activity of thymol at different concentrations determined by filter paper disk

图1 滤纸片法测定不同质量浓度麝香草酚的抑菌圈直径Fig.1 Antimicrobial diameter of thymol at different concentrations determined by filter paper disk

2.2 牛津杯法抑菌测定结果

表2 牛津杯法测定不同质量浓度麝香草酚的抑菌效果Table2 Antimicrobial activity of thymol at different concentrations determined by Oxford-cup test

图2 牛津杯法测定不同质量浓度麝香草酚的抑菌圈直径Fig.2 Antimicrobial diameter of thymol at different concentrations determined by Oxford-cup test

由表2、图2可知，随着麝香草酚质量浓度的增加，抑菌作用不断增强。麝香草酚质量浓度为1000μg/mL时，测定的抑菌圈直径大小次序为：金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌＞枯草芽孢杆菌＞保加利亚乳杆菌＞变形杆菌＞酿酒酵母＞异常汉逊氏酵母＞嗜热乳酸链球菌＞黑曲霉＞黄曲霉。与滤纸片法相比抑菌结果之所以有差别，可能是每次加入的菌悬液浓度有误差，或者实验操作有误差所致。

2.3 扩散法(打孔法)测定抑菌结果

由表3、4及图3可知，麝香草酚对细菌、酵母和霉菌均有较强的抑制作用，是一种广谱性抑菌剂。其中对细菌的抑制作用要强于酵母菌和霉菌，尤其对细菌中的金黄色葡萄球菌抑菌作用最强。麝香草酚质量浓度为1000μg/mL的抑菌能力比0.1%苯甲酸钠效果稍强一些。酚类物质具有抑菌性机理可能是[14]：菌体蛋白质与酚类物质通过氢键或疏水作用相结合从而丧失了活性；抑制了微生物细胞中的特定酶，使代谢过程发生异常；可能与微生物细胞生长所必需物质结合，导致微生物死亡等。

表3 扩散法测定不同质量浓度麝香草酚的抑菌效果Table3 Antimicrobial activity of thymol at different concentrations determined by diffusion test

图3 扩散法测定不同质量浓度麝香草酚的抑菌圈直径Fig3 Antimicrobial diameter of thymol at different concentrations determined by diffusion test

表4 麝香草酚、苯甲酸钠对细菌的抑菌效果Table4 Antimicrobial effects of thymol and sodium benzoate

2.4 最低抑菌质量浓度(MIC)的测定结果

由表5可知，MIC测定结果得到了10种菌的最低抑菌质量浓度，对细菌的抑制作用最强，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的最低抑菌质量浓度分别为10、20、20μg/mL。麝香草酚对食品污染菌的抑菌作用大小比较：对细菌抑制作用＞对酵母抑制作用＞对霉菌抑制作用。对霉菌抑菌效果差可能是由于霉菌大多是通过孢子繁殖，麝香草酚则是通过琼脂培养基慢慢扩散与细胞接触，因而对孢子抑制作用稍差而致[15]。麝香草酚是从可食用植物中提取出来的，安全性高，可考虑作为一种良好的天然食品防腐剂开发使用。

表5 麝香草酚对供试菌的最低抑菌质量浓度Table5 MIC of thymol against different bacteria

3 结 论

具有抗菌作用的植物的使用要远比抗生素的历史久远的多，从植物中寻找毒副作用小、安全性高的天然植物防腐剂，一直是研究的热点[16-20]。麝香草酚的资源丰富，成本低，对细菌、霉菌、酵母都有较强的抑制作用。实验研究表明，麝香草酚对食品中常见的10种污染菌均有一定抑菌效果，其中，对细菌的抑制作用最强，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的最低抑菌质量浓度分别为10、20、20μg/mL。总体来看，麝香草酚对食品污染菌的最低抑菌质量浓度都很小，在10～160μg/mL之间，而作为食品添加剂的用量一般在10g/L以下，麝香草酚抑菌剂量远低于这个标准。因此是一种潜在的、很有前途的食品防腐剂。尽管麝香草酚的抑菌作用很好，但是其带有一种强烈的芳香味可能对食品的风味会产生一些不好的影响，因此限制了其使用的范围，如何在保持其最大抑菌活性的基础上，降低或消弱其强烈的芳香味，还有待进一步研究。

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Antimicrobial Activity of Thymol against Foodborne Pathogenic Bacteria

WANG Di，XU Hui，QIAN Shi-quan，CAO Ke-ke，REN Mao-sheng，TIAN Chang-cheng
(Department of Biology and Food-Engineering, Bengbu College, Bengbu 233030, China)

The antimicrobial activity of thymol against foodborne pathogenic bacteria was studied by filter paper disks, Oxferd-cup test and diffusion test. The minimum inhibitory concentrations of thymol against10 kinds of foodborne pathogenic bacteria such as Proteus vulgaris, Lactobacillus bulgaricus, Streptococus thermophilus, Hansenula Anomala, Saccharmuces cerevisiae, Aspergillus niger and Aspergillus flavus were determined. The results showed that thymol had obvious antimicrobial activity against these foodborne pathogenic bacteria in wide-spectrum manner. The minimum inhibitory concentrations of thymol against Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, and Escherichia coli were 10, 20 μg/mL and 20 μg/mL, respectively.

thymol；antimicrobial activity；filter paper disk；Oxferd-cup test；diffusion test

TS202.3

A

1002-6630(2013)03-0119-04

2011-12-04

安徽省高校优秀青年人才基金项目(2010SQRL116)

王娣(1976—)，女，副教授，硕士，研究方向为食品生物技术。E-mail：Wangdibbxy@yahoo.cn