不同处理条件小黑豆乳清蛋白的抗肿瘤作用

王 菲，王常青*，樊 迎，于书佳，原 敏，连伟帅

(山西大学生命科学学院，山西 太原 030006)

黑豆为豆科植物大豆(Glycine max(L.) merr)的黑色种子[1]，黑豆主要分布在我国“三北”地区，约占全国大豆栽培面积的8%左右。黑豆按颗粒大小分为大粒种黑豆(大黑豆)和小粒种黑豆(小黑豆)。小黑豆俗称马料豆，蛋白质含量比其他种类的大豆约高10%，达50%左右[2]，不但是一种营养丰富的高蛋白食材，而且从中医角度来讲有补肾强身、解毒益肝、壮筋骨、抗衰老之功效[3]。研究表明，在小黑豆蛋白中，乳清蛋白为8%～10%，其含量和分子质量分布与其他大豆略有不同。小黑豆乳清蛋白中的主要成分是胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitor，TI)，TI被普遍认为是抗营养因子，可抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶活性，降低蛋白质的消化和吸收利用，同时TI还可作用于胰腺，造成胰腺肥大。有研究认为，低浓度的TI可以降低癌症发病率[1]，但本实验前期发现，含TI 68%的乳清蛋白在低于1.5g/kg摄入剂量时，并不能体现显著的抗肿瘤效果；而高于3g/kg剂量时抗肿瘤效果较好，但会造成动物胰腺肿大。所以，本实验研究不同温度热处理小黑豆乳清蛋白，以求得在保持一定的抗癌活性的同时，降低其抗营养性。实验还比较不同温度处理的小黑豆乳清蛋白的抗肿瘤作用及其对免疫功能的影响，以研究和探讨小黑豆乳清蛋白处理方法与抗肿瘤效果之间的关系，为小黑豆乳清蛋白功能食品的开发提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与动物

实验所用小黑豆由山西省静乐县农业局提供；S180腹水瘤由山西省肿瘤医院提供；绵羊红细(SRBC)和豚鼠血清由山西医科大学免疫实验室提供；SPF级昆明小鼠，雄性，4周龄，体质量18～22g，山西医科大学动物中心提供。

2,4-二硝基氯苯(DNCB) 天津市光复精细化工研究所；注射用环磷酰胺 江苏恒瑞医药股份有限公司；Na-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺盐酸盐(BAPNA) 上海蓝季科技发展有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

Sephadex凝胶色谱系统、UVD-680-3紫外检测仪上海金达生物科技有限公司；SP-2012UVPC紫外分光光度计 上海光谱仪器有限公司；低温高速离心机 上海兰亭设备有限公司；匀浆器 上海博通经贸有限公司；光学显微镜 上海彼爱姆光学仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小黑豆乳清蛋白的制备与处理

将脱脂小黑豆粉与水按质量比1:10混合，用NaOH调pH8.5，55℃提取1h，离心取上清；沉淀物以前述工艺提取2次，合并上清液，并调pH4.3沉淀去除球蛋白，得到小黑豆乳清蛋白滤液。该滤液经高真空浓缩后，分为两部分，并分别在65℃和75℃微波加热10min，得到抗肿瘤实验所用的65℃处理蛋白和75℃处理蛋白。经凝胶色谱分析乳清蛋白，得知其中胰蛋白酶抑制剂Kunitz和Bowman-Birk二者占乳清总蛋白的68%。

1.3.2 小黑豆中TI活性降低率的测定

采用改良的ISO 14902:2001《动物饲料——大豆制品胰蛋白酶抑制剂活性的测定》标准及文献[4]。取10mL具塞玻璃离心管，按照以下方法加入溶液：1)标准空白：5mL BAPNA溶液，3mL去离子水，1mL 5.3mol/L醋酸；2)标准溶液：5mL BAPNA 溶液，3mL去离子水；3)样品空白：5mL BAPNA 溶液，1mL样品稀释液，2mL去离子水，1mL 5.3mol/L醋酸；4)样品溶液：5mL BAPNA溶液，1mL样品稀释液，2mL去离子水。充分混匀，于37℃水浴锅中保温10min。然后各管均加入1mL胰蛋白酶工作液，混匀，继续保温10min±5s，于2)管和4)管中分别加入1mL 5.3mol/L醋酸终止反应。充分混合上述溶液，用分光光度计在波长410nm处测定溶液吸光度(用标准空白调零)。该溶液能够至少2h保持稳定。

加热处理后，乳清蛋白中TI活性降低率的计算方法[5]为：

式中：ΔA1是加热处理后的乳清测得的吸光度与酶液的吸光度之差；ΔA2是原小黑豆乳清液测得的吸光度与酶液的吸光度之差。

1.3.3 S180肿瘤小鼠模型的建立

在无菌条件下抽取腹腔保种10d的小鼠S180细胞，用生理盐水调整细胞浓度为3.0×107个/mL。除基础组外，每只小鼠右腋皮下接种0.2mL肿瘤细胞悬液。

1.3.4 动物分组及实验过程

动物接种S180肿瘤后24h，随机分为基础组、肿瘤模型组、环磷酰胺阳性对照组，65℃和75℃蛋白高、低剂量组共7组，每组10只小鼠。各高、低剂量蛋白组分别按10、3g/(kg·d)喂食(以乳清中的蛋白的质量/体质量计)，阳性对照组腹腔注射环磷酰胺20mg/(kg·d)。实验期为14d。实验第9天，用DNCB致敏各组动物(除基础组)；第10天，对各组动物进行SRBC血清溶血素实验。14d实验结束后，测定小鼠瘤径、白细胞数量、免疫器官指数、耳肿胀度和血清半数溶血值等生化指标。

1.3.5 免疫器官指数及白细胞数测定

各组动物连续给药14d后24h，称体质量并测量肿瘤直径，眼眶取血计数白细胞总数。之后处死动物，剥离肿瘤、胸腺、脾脏等组织，用滤纸吸干后称其质量，计算抑瘤率、瘤与体质量比和各脏器指数[6]。

式中：d1、d2、d3为肿瘤3个互相垂直的直径/mm。

1.3.6 细胞免疫-迟发型免疫变态反应实验[7]

实验第9天，除基础组外各组小鼠用脱毛剂脱毛腹部皮肤，面积约3cm×3cm，用1% DNCB溶液50μL均匀涂抹于脱毛处致敏。第14天用1% DNCB溶液10μL攻击小鼠右耳。基础组同样涂耳，攻击24h后，颈椎脱臼处死，剪下左右耳壳，用R8mm打孔器取耳片称质量，以左右耳片质量之差为肿胀度。

1.3.7 体液免疫-血清溶血素实验[8]

参照文献[8]中方法制备绵羊红细胞(SRBC)和补体制备。实验第10天，用生理盐水将压积SRBC配成2%的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。

第14天实验结束后24h，摘眼球取血，收集血清。每份血清用生理盐水稀释200倍，取稀释血清1mL置试管内，依次加入10% SRBC 0.5mL、10%补体1mL，另设不加血清的空白对照管(血清用生理盐水代替)。混合后37℃恒温箱保温30min，置冰浴中终止反应。2000r/min离心取上清液1mL，加都氏试剂3mL；同时取10% SRBC 0.25mL，加都氏试剂至4mL与另一试管内(该管测定的OD值即为SRBC半数溶血值)，充分混匀，放置10min后，于波长540nm处以空白对照管调零，分别测定各管光密度值。按式(8)计算各实验组半数溶血值HC50。

1.3.8 统计分析

实验数据均采用±s表示，用SPSS软件对结果进行方差分析和检验。

2 结果与分析

2.1 加热对小黑豆乳清中TI活性的影响

小黑豆乳清蛋白经65℃、10min微波处理后，TI活力降低率为30.2%；经75℃、10min微波处理后，小黑豆TI活力降低率为55.0%。由此可见，小黑豆乳清蛋白经65℃和75℃处理，TI均有所下降，且前者小于后者。

2.2 小黑豆乳清蛋白对S180肿瘤的抑制作用

表1 小黑豆乳清蛋白对S180肿瘤的抑制作用(±s，n=10)Table 1 Effect of whey protein from small black soybean on S180 tumor growth in vivo(±s，n=10)

表1 小黑豆乳清蛋白对S180肿瘤的抑制作用(±s，n=10)Table 1 Effect of whey protein from small black soybean on S180 tumor growth in vivo(±s，n=10)

注：a.与模型组相比，差异显著(P＜0.05)；b.与模型组相比，差异极显著(P＜0.01)； c.与65℃同剂量蛋白组相比差异显著(P＜0.05)。下同。

组别 平均瘤直径/mm 瘤与体质量的比/% 抑瘤率/%模型组 1.81±0.14 4.52±0.68阳性对照组 1.57±0.11b 2.13±0.91b 72.9 65℃蛋白高剂量组 1.56±0.04b 2.67±0.66b 35.8 65℃蛋白低剂量组 1.69±0.08a 3.82±1.02a 14.3 75℃蛋白高剂量组 1.46±0.03b 2.08±0.71bc 41.8 75℃蛋白低剂量组 1.53±0.06bc 2.93±0.88bc 20.5

由表1可见，与模型组相比，对于平均瘤径和瘤与体质量比两项指标来说，阳性对照组、75℃蛋白高、低剂量组和65℃蛋白高剂量组降低极显著(P＜0.01)；65℃蛋白低剂量组降低显著(P＜0.05)。各组抑瘤率顺序为：阳性对照组＞75℃蛋白高剂量＞65℃蛋白高剂量＞75℃蛋白低剂量＞65℃蛋白低剂量组。比较75℃和65℃同剂量蛋白组可见，在相同摄入剂量时，前者的瘤与体质量比明显低于后者(P＜0.05)。

2.3 小黑豆乳清蛋白对脏器指数的影响

由表2可见，各实验组胰脏指数无统计学差异(P＞0.05)，说明经65℃和75℃处理的小黑豆乳清蛋白对小鼠胰腺无明显影响，无致胰腺肿大作用。基础组的肝脏指数显著低于模型组和各实验组(P＜0.05)，说明肿瘤移植会使小鼠的肝脏指数增加。胸腺和脾脏是机体的重要免疫器官，其结构的正常与否直接影响机体的免疫功能。与模型组相比，阳性对照组的脾脏指数、胸腺指数降低极显著(P＜0.01)，说明环磷酰胺对小鼠这两个免疫器官有明显的抑制作用。而75℃蛋白高、低剂量两组的胸腺指数与其他各组相比明显提高(P＜0.05)，与基础组处于同一水平。说明75℃处理组对荷瘤小鼠的免疫器官有明显促进作用，其效果好于65℃处理组。

表2 小黑豆乳清蛋白对小鼠脏器指数的影响(±s，n=10)Table 2 Effect of whey protein from small black soybean on organ index of S180-bearing mice(±s，n=10)

表2 小黑豆乳清蛋白对小鼠脏器指数的影响(±s，n=10)Table 2 Effect of whey protein from small black soybean on organ index of S180-bearing mice(±s，n=10)

肝脏指数/(mg/g)基础组 7.42±1.79 0.98±0.32a 12.93±1.01 49.19±5.70a模型组 6.23±0.51 0.70±0.10 13.27±0.82 52.48±1.89阳性对照组 4.43±0.43b 0.45±0.03b 12.88±1.16 50.23±5.51 65℃蛋白高剂量组 6.97±1.43 0.82±0.16 12.90±0.61 53.68±0.40 65℃蛋白低剂量组 6.77±1.44 0.71±0.08 13.00±0.76 52.23±0.93 75℃蛋白高剂量组 7.96±1.84 1.08±0.04a 12.76±0.84 50.91±2.35 75℃蛋白低剂量组 6.82±0.59 0.93±0.20a 12.92±0.56 50.91±2.35组别 脾脏指数/(mg/g)胸腺指数/(mg/g)胰脏指数/(mg/g)

2.4 小黑豆乳清蛋白对免疫细胞及免疫功能的影响

表3 小黑豆乳清蛋白对小鼠免疫细胞及免疫功能的影响(±s，n=10)Table 3 Effect of whey protein from small black soybean on the immune cells and immune function of S180-bearing mice(±s，n=10)

表3 小黑豆乳清蛋白对小鼠免疫细胞及免疫功能的影响(±s，n=10)Table 3 Effect of whey protein from small black soybean on the immune cells and immune function of S180-bearing mice(±s，n=10)

(106个/mL) 肿胀度/% 半数溶血值HC50基础组 12.4±3.3b 19.5±2.67b 119.74±5.54b模型组 5.15±1.78 16.73±0.88 99.87±3.77阳性对照组 6.00±2.16 18.26±1.14b 119.20±2.95b 65℃蛋白高剂量组 9.67±0.58b 17.15±0.99a 113.04±5.59b 65℃蛋白低剂量组 7.12±1.32a 17.06±0.91a 109.27±2.76b 75℃蛋白高剂量组 13.50±1.11bc 19.43±0.49bc 121.18±5.43bc 75℃蛋白低剂量组 9.07±0.81bc 18.97±1.77bc 115.87±7.93bc组别 白细胞数/

由表3可见，各实验组血清溶血素值都比模型组极显著提高(P＜0.01)；模型组的白细胞数、肿胀度和半数溶血值都显著低于基础组(P＜0.01)，免疫损伤最大。75℃蛋白高剂量组的白细胞数等3项免疫指标与基础组处于同一水平，免疫调节效果最好。与模型组比，阳性对照组小鼠的白细胞无显著增加(P＞0.05)，65℃蛋白高、低剂量组显著升高(P＜0.05)，75℃各实验组升高极显著(P＜0.01)。阳性对照组和75℃蛋白高、低剂量组小鼠的耳壳肿胀度与模型组相比增加极显著(P＜0.01)，65℃蛋白高、低剂量组的肿胀度增加显著(P＜0.05)，说明各实验组对细胞免疫功能下降有显著抑制作用。75℃和65℃同剂量蛋白组对比，白细胞数、耳壳肿胀度和血清半数溶血值3个指标均存在显著差异(P＜0.05)，反映在小鼠的非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫方面，均为75℃处理组优于65℃处理组。

3 讨 论

有研究认为，TI有抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性、降低蛋白质消化吸收等抗营养作用，并可致胰腺肿大或引发炎症，但低浓度的TI具有降低癌症发病率的作用[9-10]。一般认为，当一种受试物使肿瘤小鼠的抑瘤率达到30%以上时，表明该受试物可以有效抑制肿瘤生长[11]。但是本实验前期发现，含TI 68%的小黑豆乳清蛋白如果不经热处理，在低于1.5g/kg摄入剂量时的抗肿瘤效果不显著；高于3g/kg剂量时抗肿瘤效果虽好，但会致动物胰腺肿大。因此，本实验对含TI 68%的小黑豆乳清蛋白75℃和65℃处理后，以3g/(kg·d)和10g/(kg·d)的剂量喂食小鼠，结果表明，小黑豆乳清蛋白在75℃和65℃处理后，TI活力分别降低了55.0%和30.2%，TI抗营养性降低了，喂食小鼠后胰脏指数与基础组相比无明显差异；同时发现，相同剂量条件下，所有75℃蛋白处理组的抑瘤率均优于65℃蛋白组，75℃和65℃处理组的S180抑瘤率分别为41.8%、35.8%。因此，从降低抗营养性和保持TI的较高抗肿瘤活性的角度看，用75℃处理乳清蛋白效果较好，而该温度处理后抗肿瘤效果优于65℃处理的原因可能是，75℃处理使乳清蛋白中TI的构型改变适度，使具有增强免疫或抗肿瘤活性基团的外展比65℃处理更充分[12]。

本实验发现，肿瘤移植会使小鼠的肝脏指数增加，可能是肿瘤细胞的繁殖对肝脏产生损伤，导致肝脏细胞代偿性增生同时伴随肥大[13]，从而使小鼠肝脏质量增加。胸腺、脾脏是重要的免疫器官，实验发现，75℃蛋白组的胸腺指数与65℃蛋白组及模型组相比明显提高，这可能与小黑豆乳清蛋白在75℃处理后抗氧化能力提高及对机体的保护性提高有关。而各实验温度和剂量的蛋白组动物的脾脏指数与基础组相比无显著差异，说明小黑豆乳清蛋白对小鼠免疫器官无明显抑制作用。而环磷酰胺阳性组小鼠的胸腺和脾脏器官都受到显著的抑制。在相同剂量时，75℃处理组抑制荷瘤小鼠各项免疫功能下降的作用也明显好于65℃处理，且呈一定的量效关系，与抑瘤率的实验结果相对应，因此小黑豆乳清蛋白抗肿瘤作用可能是通过增强免疫细胞、免疫分子对肿瘤细胞的杀伤能力并防止肿瘤的扩散和转移，调动和增强动物抗肿瘤免疫活性；或者是通过增强机体的非特异性免疫能力，起到间接抑制S180肿瘤细胞生长的作用。至于热处理温度对乳清蛋白分子结构的变化及作用机理还有待进一步研究。

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