黑米花青苷复方胶囊对实验性肝损伤的保护作用

路宏朝，王杨科，李丽霞，张 涛,2，李新生，王 琦,2,*

(1.陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西 汉中 723000；2.陕西省资源生物重点实验室，陕西 汉中 723000；3.陕西省黑色有机食品工程技术研究中心，陕西 汉中 723000)

据古文献记载，黑米具有滋阴补肾、健脾肝、明目活血之功效，因此黑米又有 “补血米”、“长寿米”的美称[1]，其颜色由花青苷类物质在米皮和胚乳上沉积而形成。黑米花青苷是花青啶与各种糖以糖苷键结合形成的糖苷，存在于黑稻的果实、茎、叶器官的细胞液中[2-3]，属于黄酮多酚类化合物，具有多种营养和药理作用[3-8]。Zhang Mingwei等[9]研究发现黑米的抗氧化作用与其中所含的黄酮和花青苷类物质关系密切。钱松[10]研究发现黑米花色苷素对机体具有促进免疫的活性和重要的免疫调节作用。侯方丽等[11]研究发现，黑米花色苷能显著降低CCl4肝损伤小鼠的肝酶活性，减轻对肝组织病理学损伤，表现明显的护肝作用。因此，黑米花青苷作为一种较安全的天然色素资源，在食品和医药方面显示出广阔的应用前景[12-13]。

本项目前期已研制出黑米花青苷复方胶囊[14]，为研究其在肝脏损伤中起到保护作用，通过建立小鼠CCl4肝损伤病理模型，采用该药物进行治疗，初步探索研究黑米花青苷复方胶囊在CCl4肝损伤中起到的防治效果。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

黑米花青苷复方胶囊由陕西省资源生物重点实验室和陕西省黑色有机食品工程技术研究中心研制并提供，有效成分：黑米花青苷、二苯乙烯苷、菌多糖。低剂量：3.098mg/粒；高剂量： 88.339mg/粒[14]。助悬剂：大豆油。

昆明小鼠，体质量18～22g，雄性，体质健康，毛色光滑雪白，购买于西安交通大学医学院(陕动字第08-005号)。

考马斯亮蓝试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、谷胱甘肽(GSH)试剂盒 南京建成生物工程研究所；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒北京科盈美科技有限公司。

玻璃匀浆管、微量移液器 德国Eppendorf公司；台式离心机 湘仪离心机仪器公司、N772可见分光光度计 上海精密科学仪器公司；680型酶标仪 美国伯乐公司；2215型石蜡切片机 德国徕卡公司；DP20奥林巴斯显微镜 日本奥林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 实验动物及分组

将动物随机分为6组：正常组、模型组、助悬剂Ⅰ组、助悬剂Ⅱ组、低剂量组、高剂量组，每组10只，置于通气良好的室内给予充足食物进行分笼饲养。

1.2.2 药物配制

分别将低剂量药物和高剂量药物溶于蒸馏水，配制成质量浓度为0.4mg/mL和0.6mg/mL的混合剂，0～4℃冷藏备用；将大豆油配制成质量浓度为0.25mg/mL混合剂Ⅰ和0.15mg/mL的混合剂Ⅱ。

1.2.3 造模及给药

采用CCl4造成肝损伤模型，分别给模型组、低剂量组、高剂量组每只小鼠腹腔注射20%的四氯化碳橄榄油0.1mL，2次/周。造模与给药同时进行，正常组、模型组每天灌胃蒸馏水0.4mL，助悬剂Ⅰ组灌胃混合剂Ⅰ0.3mL，助悬剂Ⅱ组灌胃混合剂Ⅱ0.3mL，低剂量组灌胃低剂量药物0.4mL(相当于7.57mg/(kg·d))，高剂量组灌胃高剂量药物0.4mL(相当于10.60mg/(kg·d))。5周后，停止腹腔注射和灌药，处死。

1.2.4 指标及测定

取肝脏制备肝组织匀浆液，检测肝组织中蛋白质含量、SOD活力、MDA、GSH和TNF-α水平，均按试剂盒说明操作。

1.2.5 肝脏病理学检查

取肝组织用10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，HE染色，普通光镜观察。

1.3 数据处理

原始数据通过SPSS11.0 软件中的ANOVA程序处理。

2 结果与分析

2.1 肝组织匀浆生化指标检测

表1 肝组织中SOD的活力和MDA的含量(±s，n= 10)Table 1 SOD activity and MDA content in liver tissue( ±s，n= 10)

表1 肝组织中SOD的活力和MDA的含量(±s，n= 10)Table 1 SOD activity and MDA content in liver tissue( ±s，n= 10)

注：a.与正常组比较，有显著性差异(P＜0.05)，aa.与正常组比较，有极显著性差异(P＜0.01)；b.与模型组比较，有显著性差异(P＜0.05)；bb.与模型组比较，有极显著性差异(P＜0.01)。下同。

组别 SOD活力/(U/mg pro) MDA含量/(nmol/mL)正常组 56.35±0.77 0.94±0.11模型组 48.13±7.22a 2.53±1.61aa助悬剂Ⅰ组 58.74±5.66b 2.19±0.40aabb助悬剂Ⅱ组 66.83±1.10aabb 1.84±0.63abb低剂量组 63.24±5.29abb 1.23±0.34bb高剂量组 66.75±6.49aabb 1.27±1.26bb

由表1可见，与正常组比较，模型组小鼠肝组织匀浆中SOD的活性显著降低，MDA的含量显著上升；而黑米花青苷复方胶囊低剂量和高剂量能显著升高小鼠肝脏中SOD活性，降低MDA的含量；同时，两助悬剂组相对于正常组，SOD活力和MDA的含量都有所提高。

表2 肝组织中GSH 的含量和TNF-α的水平(±s，n= 10)Table 2 GSH content and TNF-α level in liver tissue(±s，n= 10)

表2 肝组织中GSH 的含量和TNF-α的水平(±s，n= 10)Table 2 GSH content and TNF-α level in liver tissue(±s，n= 10)

组别 GSH含量/(mg/mL) TNF-α含量/(pg/mL)正常组 3.40±1.12 19.92±4.58模型组 2.66±0.97 20.17±5.58助悬剂Ⅰ组 2.63±0.70 15.54±2.82助悬剂Ⅱ组 2.84±0.36 16.01±1.56低剂量组 4.76±1.64abb 11.79±1.61aabb高剂量组 5.42±0.75aabb 4.78±3.39aabb

由表2可见，与正常组比较，模型组和两助悬剂组的GSH和TNF-α含量较低，但无统计学意义。与模型组比较，高剂量和低剂量药物都能极显著升高小鼠肝脏中GSH的含量，降低TNF-α的水平。

2.2 肝组织病理变化

正常组肝组织结构正常，肝小叶结构清楚，肝细胞条索明显，无变性坏死、炎性细胞浸润、纤维组织增生(图1a)。模型组肝索排列杂乱无章，中央静脉肿胀、充血。肝组织内纤维结缔组织大量增生，形成完整的假小叶，界限清楚。肝细胞肿胀、破裂，肝窦内胆汁淤积，炎性细胞浸润(图1b)。助悬剂Ⅰ组和助悬剂Ⅱ组肝小叶结构基本清晰，肝细胞结构完整，无明显变性(如图1c、1d)。低剂量组肝索不明显，纤维结缔组织中度增生，形成不完整的假小叶，炎性细胞浸润，肝细胞肿胀，胞质内可见大小不等、数量不一的脂肪空泡(图1e)。高剂量组肝索排列有规律，纤维结缔组织增生较轻，没有形成完整的假小叶，肝细胞结构较完整，炎性细胞浸润和脂肪变性程度都比模型组、低剂量组低(图1f)。

图1 各实验组小鼠肝脏组织形态(×100)Fig.1 Hepatic tissues of mice from different groups(×100)

3 讨 论

CCl4是一种典型的肝脏毒物，是长期以来公认的复制肝损伤动物模型的化学物质。许多研究认为CCl4复制的肝损伤可模拟病毒性肝损伤，其表现出来的症状、肝功能检测指标、肝脏病理改变与病毒性肝炎具有相似性[15]。CCl4在体内经过药物代谢酶的作用，如P-450微粒体酶系统，将CCl4去掉一个氯原子，而形成三氯甲烷，即氯仿，则成为肝细胞内质网和微粒体的药物代谢酶系统的剧毒(产生三氯甲基自由基和氯自由基)，引起肝细胞生物膜的脂质过氧化及肝细胞损害。本实验采用腹腔注射0.1mL 20% CCl4的方法建立小鼠肝损伤模型，5周后，肝脏出现明显的纤维化，形成假小叶，肝细胞肿胀、破裂，并伴有炎性细胞浸润。说明本研究成功复制了小鼠CCl4实验性肝损伤模型。

本实验中，低剂量组和高剂量组小鼠肝脏中SOD的活力显著升高，且随着药物浓度的增加而增强，表明黑米花青苷复方胶囊可提高机体清除自由基的能力。MDA含量的高低直接反应肝脏中脂质过氧化损伤程度。低剂量和高剂量组都能显著降低肝脏中的MDA含量，说明黑米花青苷复方胶囊能够有效防止肝细胞的脂质过氧化。GSH是细胞内重要的还原产物，机体产生过多的氧自由基能使GSH含量明显下降[16]。本研究通过测定GSH含量来反映谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的高低。结果表明，两种剂量的黑米花青苷复方胶囊都可以显著增加GSH的活性，由此可分析，黑米花青苷复方胶囊保肝作用可能与其抗氧化性有关，能够提高SOD和GSH-Px的活性，清除自由基，阻止肝细胞脂质过氧化，维持细胞质膜的正常结构，以降低肝细胞的损伤程度。TNF-α是肝损伤的一种重要炎症因子，主要由激活的Kupffer细胞产生[17]。TNF-α也会引起许多与肝损伤有关的介质如IL-1β的出现，同时诱导其他炎性介质产生。另一方面，也可通过诱导氧自由基的产生及脂质过氧化反应、诱导NO产生、促进肝细胞凋亡等途径引起肝细胞的损伤。在本实验中，低剂量组、高剂量组TNF-α水平都显著下降，说明两药物通过减轻炎症反应和阻止氧自由基的产生，对肝细胞起到保护作用。

病理组织学观察，模型组小鼠肝脏出现明显的纤维化，形成完整的假小叶，肝细胞肿胀、广泛性坏死，并伴有严重的炎性细胞浸润。低剂量和高剂量组症状都有所减轻，尤其高剂量组显著地改善肝小叶变性、坏死的范围和程度，减轻了炎性细胞的浸润，进一步表明黑米花青苷复方胶囊对CCl4所致的肝损伤具有保护作用。

同时，两助悬剂组与正常组比较，仅助悬剂Ⅱ组的SOD活力显著升高，MDA的含量与助悬剂Ⅰ组比较有所降低，而对GSH含量和TNF-α水平没有影响。组织学观察，助悬剂组肝脏无明显病变，说明它们不影响黑米花青苷复方胶囊的效果。因此，选用此助悬剂是较为安全的。

综上所述，黑米花青苷复方胶囊对小鼠CCl4引起的肝损伤有较好的保护作用，具体机制的深入研究尚在进行中。

[1]孔令瑶.黑米中生物活性物质的研究[D].无锡: 江南大学, 2008.

[2]曹小勇, 李新生.黑米花色素苷类色素研究现状及展望[J].氨基酸和生物资源, 2002, 24(1): 3-6.

[3]王锋, 邓洁, 谭兴和, 等.花色苷及其共色作用研究进展[J].食品科学, 2008, 29(2): 472-476.

[4]SEOK H N, SUN P C, MI Y K, et a1.Antioxidative activities of bran extracts from twenty one pigmented rice cultivars[J].Food Chemistry,2006, 94: 613-620.

[5]王艳龙, 石绍福, 韩豪, 等.中国黑米花色苷研究现状及展望[J].中国生化药物杂志, 2010, 31(1): 63-66.

[6]李春阳, 许时婴, 王璋.葡萄籽原花青素结构单元的红外光谱分析[J].食品与生物技术学报, 2005, 24(4): 47-51.

[7]LI xingsheng, LONG shuming, WU sanqiao, et al.Investigation of anthocyanin extraction from black rice and light stability of anthocyanin-containing alcoholic drink[J].CIGR Journal, 2011,13(Special issue): 151-159.

[8]吴三桥, 史隋孝, 丁锐, 等.黑米中花青苷色素的测定方法研究[J].氨基酸和生物资源, 2002, 24(3): 66-68.

[9]ZHANG Mingwei, GUO Baojiang, CHI Jianwei, et al.Antioxidations and their correlation with total flavones and anthocyanin contents in different black rice varieties[J].Agric Sci China, 2005, 38(7):1324-133.

[10]钱松.黑米花青苷对机体免疫生化功能影响的研究[D].温州: 温州医学院, 2009.

[11]侯方丽.黑米花色苷对CCl4诱导小鼠肝损伤的保护作用及其抗氧化机制[D].武汉: 华中农业大学, 2009.

[12]郭红辉, 凌文华.黑米花青苷研究进展[J].食品研究与开发, 2008,29(3): 133-135.

[13]钟岩, 李泽鸿, 邵明富.黑米色素的提取方法及稳定性研究[J].北方园艺, 2008(10): 71-73.

[14]石绍福.黑米花青苷组分分析及软胶囊研制[D].汉中: 陕西理工学院, 2011.

[15]WEBER L W, BOLL M, STAMPFL A.Hepatotoxicity and mechaiism of action of haloalkanes: carbon tetrachloride as a toxicological model[J].Critical Reviews in Toxicology, 2001, 33(2): 105-132.

[16]柳茜, 肖俊.当归多糖预防急性四氯化碳性肝损伤及其作用机制[J].中国医学研究与临床, 2006, 4(3): 4-5.

[17]KISHORE R, HILL J R, MCMULLEN M R, et a1.ERK 1/2 and Egr-1 contribute to increased TNF-alpha production in rat Kupffer cell safter chronic ethanol feting[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2002, 282(1): 6-15.