海带多糖硫酸酯对bFGF诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响

刘 敏，彭臻菲，方哲翔，张其清,*，许小平

(1.福州大学生物和医药技术研究院，福建 福州 350002；2.福州大学化学化工学院，福建 福州 350002)

心脑血管疾病是中老年人的常见病和多发病，动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心脑血管疾病的主要病理基础。研究表明早期AS的形成是以血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)异常增殖并迁移至内膜下吞噬脂质作为病变基础[1]，因此抑制VSMC过度增殖对防治AS具有重要意义。

海带在我国有悠久的食用历史，是天然的保健食品，具有提高免疫力、预防心脑血管疾病等功效[2-3]。近些年来研究表明，海带的药用价值与其多糖成分密切相关[4]。海带中提取的多糖具有抗氧化、抗凝血、降血脂等多种生物活性[5-8]，但目前对其抗AS的机制探讨较少。本实验通过碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)诱导建立VSMC增殖模型，研究海带多糖硫酸酯对VSMC增殖的影响，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海带，购自福建省福州市场，经鉴定为Laminaria japonica；DMEM培养基 美国Gibco公司；胎牛血清(FBS) 生工生物工程(上海)有限公司；四甲基偶氮唑盐(MTT) 美国Biosharp公司；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 加拿大Bio Basic 公司；兔抗α-Actin多克隆抗体北京博奥森生物技术有限公司；超敏即用型二步法检测试剂盒 北京中杉金桥生物技术有限公司；黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase) 瑞士Roche公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 海带多糖硫酸酯的制备

[5,9-11]的方法，制备海带多糖硫酸酯。具体步骤为：粉碎海带后取干粉80g，加入1.6L无水乙醇脱脂，60℃水浴3h，不断搅拌；过滤，烘干滤渣，称取60g，加入3L蒸馏水，沸水浴提取2次，每次3h；合并提取液，用旋转蒸发仪浓缩至2L；缓慢加入500mL无水乙醇和5g CaCl2，静置12h除去褐藻酸；过滤，加入无水乙醇，使其终体积分数为75%，静置6h；过滤，沉淀用蒸馏水溶解，真空冷冻干燥，即得海带多糖硫酸酯WPS。WPS过DEAE A-25凝胶柱，依次用含0.6、1、2mol/L NaCl的pH7.4的Tris-HCl缓冲液洗脱，部分收集器收集洗脱液，苯酚-硫酸法[12]检测各管多糖含量。以吸光度为纵坐标，管数为横坐标，得到多糖洗脱曲线。依照洗脱曲线分别合并多糖浓度较高的洗脱部分，得到WPS-1、WPS-2和WPS-3共3个多糖硫酸酯组分。多糖各组分经酸水解后，依据明胶-氯化钡法[13]测定其硫酸根含量。

1.3 抑制VSMC增殖实验

1.3.1 VSMC培养

取120～180g 雄性SD大鼠胸主动脉，置于盛有无菌DMEM的平皿中，刮除内膜面，剥取中膜层转移到盛有胎牛血清的平皿中，剪切成1mm3左右的组织块，贴至培养瓶底部，间距不超过0.5cm，加入3～4mL含有20%胎牛血清的培养液，置于37℃、5% CO2的培养箱中静置培养。5d后可见细胞从组织块周围爬出，待细胞铺满底部即用0.25%的胰酶消化传代。3代后进行细胞鉴定，实验时使用4～8代细胞。

1.3.2 VSMC鉴定

VSMC固定后，用山羊血清封闭，再加入稀释的兔抗α-Actin多克隆抗体，4℃孵育过夜后用0.01mol/L PBS清洗，按北京中杉金桥技术有限公司超敏即用型二步法检测试剂盒说明书进行操作，DAB显色。对照组用0.01mol/L PBS代替兔抗α-Actin多克隆抗体。

1.3.3 MTT法检测海带多糖硫酸酯抑制bFGF诱导的VSMC增殖

参照文献[14]的方法，将细胞配成2.5×105个/mL细胞悬液，加入96孔板中(0.2mL/孔)，37℃、5% CO2培养箱中孵育24h，饥饿处理过夜。加入不同浓度海带多糖硫酸酯(100μL/孔)作用24h后，加入bFGF继续培养。48h后将孔中培养液吸出，加入MTT(100μg/孔)，每组设置6个复孔，578nm波长处检测OD值。

各组依次加入75mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.8)1mL、样品0.2mL(对照组用蒸馏水代替)、0.1mol/L盐酸羟胺溶液0.1mL、75mmol/L黄嘌呤溶液0.1mL和0.037U/mL黄嘌呤氧化酶溶液0.1mL，混匀后37℃孵育30min。再加入2mL显色剂(0.4g/L甲萘胺+4g/L对氨基苯磺酸)，混匀后静置5min，波长530nm处测吸光度。

1.5 统计学分析

本实验中所有数据均采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，用±s表示，并对结果进行LSD-t检验。

2 结果与分析

2.1 VSMC培养

图1 原代主动脉血管平滑肌细胞(×100)Fig.1 Primary culture of vascular smooth muscle cells (×100)

由图1可见，培养5d后可见细胞从组织块周围爬出(A)，且呈梭状贴壁生长。培养至12d时可见细胞呈束状向外延伸生长(B)，至21d呈现“峰-谷”状生长形态(C)。

2.2 VSMC鉴定

由图2可见，免疫组化法鉴定平滑肌α-Actin，倒置显微镜下可见胞浆内棕黄色丝状α肌动蛋白，证实为VSMC。

图2 免疫组化法鉴定VSMC(×250)Fig.2 Identification of VSMCs by immunohistochemistry (×250)

2.3 海带多糖硫酸酯对VSMC增殖作用的影响

图3 WPS、WPS-1、WPS-2和WPS-3对bFGF诱导的VSMC增殖的影响Fig.3 Effects of WPS, WPS-1, WPS-2 and WPS-3 on bFGF-induced proliferation of VSMC

通过MTT法测定OD值可反映细胞生长及增殖活性。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与活细胞数成正比，即OD578nm越高增殖活性越强。本实验对不同海带多糖硫酸酯组分对bFGF诱导的VSMC增殖的影响进行研究。由图3可知，加入bFGF诱导后，模型组VSMC增殖极显著(P≤0.01)，说明bFGF增殖模型成功建立。在海带多糖硫酸酯干预下bFGF诱导的VSMC增殖受到抑制，其中WPS对VSMC的增殖抑制作用最为显著。当WPS质量浓度为0.1mg/mL时测得细胞OD578nm下降至0.244，比模型组降低了0.026。质量浓度达到1mg/mL时，WPS对VSMC的增殖达到最大抑制作用，此时细胞OD578nm已降至0.185，抑制率为31.5%。WPS-1和WPS-3对VSMC的增殖均表现出一定的抑制作用，表现在各多糖干预组VSMC的OD值均比模型组低，尤其在高质量浓度(1mg/mL)条件下抑制作用更为明显，抑制率均在20%左右。与之相比，WPS-2对VSMC的抑制作用则不显著，在0.1～1mg/mL质量浓度条件下，抑制率均在10%以内。

表1 1 mg/mL时各样品组分对·清除力Table 1 Superoxide anion radical scavenging activity of each sample at the concentration of 1 mg/mL

表1 1 mg/mL时各样品组分对·清除力Table 1 Superoxide anion radical scavenging activity of each sample at the concentration of 1 mg/mL

样品 WPS WPS-1 WPS-2 WPS-3清除率/% 75.68± 0.45 73.04± 0.65 34.05± 3.08 90.16± 0.93

3 讨 论

本实验从大鼠胸主动脉中取得VSMC，并通过bFGF诱导建立VSMC增殖模型，用于观察海带多糖硫酸酯对VSMC异常增殖的抑制作用。实验结果表明，不同组分海带多糖硫酸酯对VSMC的增殖抑制活性各不相同。其中，WPS对VSMC的增殖抑制作用最强，WPS-1和WPS-3次之，而WPS-2对VSMC的增殖基本无影响。进一步研究发现海带多糖硫酸酯对·清除效应与其抑制VSMC增殖作用基本一致，表现为WPS、WPS-1和WPS-3具有显著的·清除力，而WPS-2对·清除力较弱。已有研究报道，bFGF刺激VSMC增殖的机制与增加细胞内活性氧浓度有关，胞内H2O2浓度的增加会激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)，从而促使VSMC 增殖[16]。对抗氧化剂Probucol抑制VSMC增殖的研究也表明，Probucol能增强超氧化物歧化酶的活性，降低细胞内活性氧的浓度，从而抑制MAPK信号通路对VSMC增殖的调控[17-18]。由此推测，海带多糖硫酸酯对VSMC异常增殖的抑制机制与其抗氧化活性密切相关，很可能通过调节细胞内活性氧水平，维持细胞内的氧化还原平衡状态，进而改变对氧化还原敏感的增殖性和抑制性信号蛋白酶和转录因子活性之间的平衡，抑制了VSMC增殖。下一步，我们将继续探讨海带多糖硫酸酯抑制VSMC增殖机制，为海带多糖在早期AS防治中的应用提供一定的理论基础。

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