分步酶解法制备菜籽降血压肽

张 艳，刘志伟*

(武汉工业学院食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023)

血管紧张素转化酶抑制剂是被世界卫生组织和我国《高血压治疗指南》规定的一线抗高血压药。其中包括第一代药物卡利普托，第二代药物西拉普利、赖诺普利、福辛普利等，而这些药物具有副作用强、和其他药物联用产生不良反应等缺点[1]，因而，人们对食源性降压肽进行了大量的研究并发现[2-7]，来源于食物蛋白的活性肽没有副作用，这些活性肽可以抑制血管紧张素转化酶的活性，称为降压肽或血管紧张素转化酶抑制肽(angiotensin-converting enzyme inhibitory peptides，ACEIP)。

研究者们已经从不同的食物中制备出降压肽，其中对大豆降压肽的研究较为全面和彻底，Donkor 等[8]从发酵食品酸奶中检测出降压肽，Lee 等[9]制备出了鲔鱼降压肽。Sivakumar等[10]以罗非鱼为原料制备出了降压肽。薛照辉[11]用碱性蛋白酶(alcalase)和复合风味酶(flavourzyme)水解菜籽蛋白得到的菜籽肽具有很好的降血压功能。张伟[12]从花生蛋白中制备出了降血压肽。本实验以菜籽蛋白为原料，通过优选蛋白酶定向分步酶解制备出具有降血压活性的肽，并对制备工艺进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菜籽蛋白：实验室自制。

马尿酰组胺酰亮氨酸(HHL)、ACE活性粉末制剂美国Sigma公司；碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶丹麦Novo公司；胃蛋白酶 国药集团化学试剂有限公司；其他所用化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

AB-L分析天平、FE20pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；TDI-5型台式离心机 上海安亭科学仪器厂；ALPHA2-4冷冻干燥机 德国博励行公司；UV752分光光度计 美国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白酶活力测定

蛋白酶活力测定采用福林-酚法[13]。

1.3.2 酶解工艺流程

配制一定质量浓度的菜籽蛋白溶液，水浴加热至一定温度，调节pH值至第1种酶的最适值，加入一定量的酶(第1种酶)，低速搅拌，用1mol/L NaOH维持pH值恒定，酶解60min，取酶解液置于沸水浴10min以钝化酶活性，冷却，调节pH值至第2种酶的最适值，加入一定量的酶(第2种酶)，低速搅拌，用1mol/L NaOH维持pH值恒定，酶解60min，取酶解液置于沸水浴10min以钝化酶活性，4000r/min离心10min，取上清液冷冻干燥。

1.3.3 酶组合的筛选

选用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶作为分步酶制剂组合筛选对象。选取底物菜籽蛋白的质量浓度为5g/100mL、加酶量为5%(酶与底物的质量比)、酶解温度和pH值在其最适条件，见表1。为水解条件进行酶解反应，酶解结束后，离心分离，取上清液冷冻干燥，然后检测水解物的血管紧张素转化酶抑制剂活性，选出ACE抑制率最高的酶组合。

表1 4种蛋白酶的最适反应条件Table 1 Optimal reaction conditions of four kinds of proteases

1.3.4 菜籽降压肽制备工艺优化单因素试验

以ACE抑制率为指标，ACE抑制率越高越好，考察酶解过程中酶解温度、加酶量、底物质量浓度对产物ACE抑制率的影响。按照1.3.2节的工艺流程，配制质量浓度为3、5、7、9、11g/100mL的菜籽蛋白，设水浴温度50℃，加酶量为7%，以ACE抑制率为指标，考察底物质量浓度对降压活性的影响；按照3%、5%、7%、9%、11%加酶量，设酶解温度50℃，底物质量浓度为5g/100mL，以ACE抑制率为指标，考察加酶量对降压活性的影响；取底物质量浓度为5g/100mL，加酶量为6%，设置酶解温度分别为30、40、50、60、70℃，以ACE抑制率为指标，考察酶解温度对降压活性的影响。

1.3.5 响应面法优化菜籽降压肽制备条件

在单因素试验基础上，根据Box-Behnken的中心组合实验设计设计原理，设定酶解温度、底物质量浓度、加酶量为3个因素，它们各自有3个水平。试验因子水平见表2。

表2 响应面设计因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface design

根据表2所设计的因素及其水平，通过Design-Expert软件采用三因素三水平的Box-Behnken 模型设计试验方案。

1.3.6 ACE抑制率的体外测定方法

目前血管紧张素转化酶活性的体外检测方法有紫外分光光度法[14-15]、高效液相色谱法[16-17]、荧光法[18-19]等。本实验采用紫外检测，根据Cushman等[14]方法，按照刘志伟等[20]的测定方法稍作改进。

2 结果与分析

2.1 酶活力测定结果

各种酶活力的测定结果为：碱性蛋白酶1.0×104U/g、中性蛋白酶10.0×104U/g、胃蛋白酶0.12×104U/g、胰蛋白酶25.0×104U/g。

2.2 蛋白酶组合的筛选

蛋白酶两两组合对菜籽蛋白进行分步水解后，其产物的ACE抑制率见表3。

表3 双酶水解产物的ACE抑制率Table 3 Angiotensin-converting enzyme inhibitory activity of hydrolysates

由表3可见，相同条件下，蛋白酶ab组合的产物ACE抑制率最高，即碱性蛋白酶和中性蛋白酶组合进行水解后，能得到较高ACE抑制率的产物，因此，选出碱性蛋白酶和中性蛋白酶作为菜籽降压肽制备条件优化的酶制剂。

2.3 菜籽降压肽制备条件的优化单因素试验

2.3.1 底物质量浓度的影响

由图1可知，实验所选取的范围内，底物质量浓度5g/100mL时，产物对ACE抑制率为最大，达到49.11%。随着质量浓度的增加，抑制率逐渐下降，原因可能是底物质量浓度的增加对酶产生抑制作用并加速了酶促反应的逆反应进行。因此确定底物质量浓度在5g/100mL。

图1 底物质量浓度对水解物ACE抑制率的影响Fig.1 Effect of substrate concentration on ACE inhibitory activity of hydrolysates

2.3.2 加酶量的影响

图2 加酶量对水解物ACE抑制率的影响Fig.2 Effect of E/S on ACE inhibitory activity of hydrolysates

由图2可知，实验所选取的范围内，随着加酶量的增加，产物对ACE的抑制逐渐增加，加酶量为5%时，ACE抑制率最大，达到48.03%，当加酶量继续增加的时候，产物的ACE抑制率逐渐下降，原因可能是酶量增加加速了酶促反应的逆反应进行，使得产物得率下降。因此确定加酶量在6%左右。

2.3.3 酶解温度的影响

图3 酶解温度对水解物ACE抑制率的影响Fig.3 Effect of temperature on ACE inhibitory activity of hydrolysates

由图3可知，实验所选取的范围内，随着反应体系温度的增加，产物对ACE的抑制逐渐增加，酶解温度在50～60℃时，ACE抑制率最大，达到47.43%～48.03%，原因是在55℃以下时，酶解温度升高使得酶促反应速率加快，超过55℃时，高温使得酶的高级结构发生改变，导致酶活力下降或者失活。因此确定酶解温度为55℃。

2.4 响应面法优化菜籽降压肽制备工艺

图4 酶解温度与底物质量浓度交互作用的响应面与等高线Fig.4 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between hydrolysis temperature and substrate concentration on ACE inhibitory activity of rapeseed protein

图5 酶解温度与加酶量交互作用的响应面与等高线Fig.5 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between hydrolysis temperature and enzyme addition amount on ACEIA of rapeseed protein

图4 ～6分别为酶解温度和底物质量浓度交互作用、酶解温度和加酶量交互作用、底物质量浓度和加酶量交互作用的响应面和等高线的图形，由图4～6可知，其作用都为上凸的曲面，最高点均落在所选区域之中，说明本实验所选择的区域较为合适。由酶解温度与底物质量浓度交互作用对ACE抑制率的影响可以看出，酶解温度在52.5～57.5℃之间，底物质量浓度在4～6g/100mL之间时存在最高值。由酶解温度和加酶量的交互作用对ACE抑制率的影响可以看出，酶解温度在52.5～57.5℃之间、加酶量在5%～7%之间时存在最高值。由底物质量浓度和加酶量的对ACE抑制率的影响交互作用可以看出，底物质量浓度在4～6g/100mL、加酶量在5%～7%的范围内达到最高值。

图6 底物质量浓度和加酶量交互作用的响应面与等高线Fig.6 Response surface and contour plots for effect of cross-interaction between substrate concentration and enzyme addition amount on ACEIA of rapeseed protein

通过三因素三水平的Box-Behnken 模型设计试验，其结果见表4。

表4 响应面试验方案及结果Table 4 Design and results of response surface tests

根据表4结果，计算各项回归系数，以这些回归系数建立菜籽多肽的ACE抑制率与酶解温度、底物质量浓度、加酶量三因子的数学回归模型，应用Design-Expert软件得到编码空间三元二次函数模型为：ACE抑制率Y=50.23－0.29A＋0.48B＋0.70C－0.12AB－1.11AC＋1.42BC－9.41A2－2.46B2－3.83C2

对上述模型试验结果进行方差分析，结果见表5。

表5 响应面试验结果方差检验Table 5 Variance analysis for the fitted quadratic polynomial model

由表5可知，模型F值检验表明显著，失拟项的F值为4.22，检验不显著，表明拟合程度明显，模型的预测值接近实际值，进一步说明该方程是显著的，此试验方法可靠。因此，可用该回归模型进行试验结果分析。

同时，由于表5中P＜0.0500 的对应项为模型影响显著项，因此，本模型中C、AC、BC、A2、B2、C2对结果影响显著。对比酶解温度、底物质量浓度、加酶量三者的F值也能看出，加酶量的影响最大，其次为底物质量浓度，酶解温度影响最小。

对函数进行分析，得到A=－0.02、B=0.13、C=0.12，此时ACE抑制率最大，最大值为50.303%，即最优的水解条件为酶解温度54.9℃、底物质量浓度5.65g/100mL、加酶量6.5%。经实验验证，此条件下制备出菜籽降血压肽的ACE抑制率为50.12%，接近于理论值。

3 结 论

通过Box-Behnken模型响应面法优化菜籽降压肽制备工艺，得到了酶解菜籽蛋白质的回归方程为ACE抑制率Y=50.23－0.29A＋0.48B＋0.70C－0.12AB－1.11AC＋1.42BC－9.41A2－2.46B2－3.83C2，通过对方程进行求解最值，得到了最优的水解条件为酶解温度54.9℃、底物质量浓度5.65g/100mL、加酶量6.5%，ACE抑制率最大值为50.303%。在优化出的工艺条件下进行验证实验，制备出ACE抑制率为50.12%的菜籽降血压肽，实际值接近于理论值，可以用于生产指导。

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