微波协同辅助复合酶法制备高F值玉米肽条件的优化

张艳荣，杨 羿，宋春春，王大为*

(吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118)

玉米蛋白粉(corn gluten meal，CGM)是生产玉米淀粉、淀粉糖或酒精的副产物[1-2]。玉米蛋白粉中主要含有醇溶蛋白68%、谷蛋白22%[3]，还有少量的球蛋白与白蛋白，其蛋白质的含量高达67%，此外还含有15%的淀粉及少量的酯类物质及纤维素[4]。目前我国年产玉米蛋白粉21万t，主要用于饲料生产，附加值很低，未充分发挥玉米的经济价值[5]。以玉米蛋白粉为原料制取多肽可以提高玉米的综合利用价值，延长玉米产业链，为玉米产业的健康发展作出贡献。微波辅助提取技术是近些年来逐渐兴起的一项新技术，具有高效、快速、安全、节能等特点[6-8]。微波作用于物料时，穿透介质到达物料的内部维管束和腺胞系统，细胞内部吸收微波能迅速升温，使其内部压力超过细胞壁膨胀承受能力，导致细胞壁破裂，细胞内有效成分流出，在较低的温度条件下即可溶于介质中，参与化学反应。微波热效率高，升温时间短，在较短的时间内即达到所需反应温度，提高生产效率[9-12]。另外，微波处理可在较高浓度条件下进行，减少用水量，降低目的物浓缩负担。目前制取玉米肽的方法主要是酸水解、碱水解、酶水解[13]，在低于酶失活温度条件下直接进行微波辅助酶解，目前尚未有报道，微波对酶特性的影响也有待于进一步研究。本研究在微波环境下进行酶解处理制取高F值玉米肽的酶解条件，为提高蛋白酶解效率和玉米肽F值，节能减排生产方式提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米蛋白粉 长春大成新资源集团有限公司；牛血清白蛋白(生化试剂) 中国世惠生化试剂有限公司；Alcalase 2.4L蛋白酶(酶活力为386408U/mL)、木瓜蛋白酶(酶活力为795639U/g) 诺维信(中国)生物技术有限公司；氢氧化钠、碳酸钠、盐酸、酒石酸钾钠(均为分析纯)北京化工厂；硫酸铜(分析纯) 沈阳市新西试剂厂。

1.2 仪器与设备

NN-J993微波炉 日本松下电器产业株式会社；TU-1901型双光束紫外-可见分光光度计 上海普析通用仪器有限责任公司；PHS-3BW型电脑数显酸度计 上海里达仪器厂；KDC-1042型低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；101A-2E型电热鼓风干燥箱 上海实验仪器厂有限公司；DZKW-4型恒温水浴锅 北京中兴伟业有限公司；L-8800氨基酸自动分析仪 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

原料预处理→玉米蛋白粉脱脂除杂处理→调节pH值→微波协同Alcalase 2.4L蛋白酶酶解→灭酶活→迅速冷却→离心分离→上清液→调节pH值→微波协同木瓜蛋白酶酶解→灭酶活→迅速冷却→冷冻干燥→高F值玉米肽

1.3.2 操作要点

1.3.2.1 原料预处理

将玉米蛋白粉按照蛋白粉与水1∶5(m/V)的比例加入20℃的清水，搅拌均匀后静置分层，测定洗涤液的pH值。弃去上清液并反复洗涤至洗涤液为中性。所得的湿玉米蛋白粉在2000r/min的条件下离心脱水处理15min，使其含水量在30%以下，其主要成分为不溶于水的醇溶蛋白，常温放置2～4d亦不会发生腐败变质，同时为防止热干燥导致玉米蛋白变性，影响玉米肽的制备，所以将其置于相对湿度不大于70%的室温条件下自然放置，并经常翻拌，晾至含水量低于12%，粉碎并筛分得到可通过0.147mm孔径筛的经洁净处理的玉米蛋白粉备用。

1.3.2.2 玉米蛋白粉脱脂除杂处理

采用超临界CO2萃取技术对预处理以后的玉米蛋白粉进行脱脂除杂处理[14]，处理条件为压力20MPa、温度45℃、时间160min。处理后的玉米蛋白粉为浅黄色，无异味，含脂率1.0%以下。

1.3.2.3 高F值玉米肽制备

Alcalase 2.4L蛋白酶酶解，酶解液100℃水浴10min灭酶处理，然后迅速冷却至室温，3500r/min的条件下离心分离15min，得上清液，调pH值，加入木瓜蛋白酶进行酶解，酶解液100℃水浴10min灭酶处理，迅速冷却，冷冻干燥即为高F值玉米肽[15-17]。

1.3.3 Alcalase 2.4L蛋白酶酶解条件的单因素试验设计

采用Folin-酚法对Alcalase 2.4L蛋白酶酶解的上清液中的多肽含量进行测定[18]，并按式(1)计算多肽转化率。

1.3.3.1 微波时间对多肽转化率的影响

在300W微波功率条件下(温度不超过60℃)，底物含量9g/100g、pH9.0、酶添加量3g/100g时，考察微波时间为1.5 、2.0、2.5、3.0、3.5min对多肽转化率的影响。

1.3.3.2 酶添加量对多肽转化率的影响

在300W微波功率条件下，底物含量9g/100g、pH9.0、微波时间2.5min时，考察酶添加量为2、3、4、5、6g/100g对多肽转化率的影响。

1.3.3.3 底物含量对多肽转化率的影响

在300W微波功率条件下，酶添加量3g/100g、pH9.0、微波时间2.5min时，考察底物含量为7、8、9、10、11g/100g对多肽转化率的影响。

1.3.3.4 pH值对多肽转化率的影响

在300W微波功率条件下，底物含量为9g/100g、酶添加量3g/100g、微波时间2.5min时，考察pH值为8.0、8.5、9.0、9.5、10.0对多肽转化率的影响。

1.3.4 木瓜蛋白酶酶解条件的单因素试验设计

蛋白酶酶解过程中产生酸性物质，酶解程度越大，产生的酸性物质越多，溶液的pH值越小，用碱液滴定时耗碱量就越大。本研究使用0.1mol/L NaOH溶液进行滴定，记录与酶解前溶液pH值相同时所消耗的碱液体积，并以其为考察指标，衡量酶解程度。

1.3.4.1 微波时间对耗碱量的影响

取Alcalase 2.4L蛋白酶酶解后的上清液60mL，微波功率100W、pH7.5、木瓜蛋白酶的酶添加量4g/100g，考察微波时间为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5min时耗碱量的变化情况。

1.3.4.2 酶添加量对耗碱量的影响

取Alcalase 2.4L蛋白酶酶解后的上清液60mL，微波功率100W、pH7.5、微波时间5min，考察木瓜蛋白酶的酶添加量为3、4、5、6g/100g时耗碱量的变化。

1.3.4.3 pH值对耗碱量的影响

取Alcalase 2.4L蛋白酶酶解后的上清液60mL，微波功率100W、微波时间5min、木瓜蛋白酶的酶添加量4g/100g，考察pH值为7.0、7.5、8.0时耗碱量的变化情况。

1.3.5 牛血清蛋白标准曲线的绘制

精确配制250μg/mL牛血清蛋白溶液，精确量取不同体积溶液，配制成不同质量浓度，测定其在500nm波长处的吸光度，绘制牛血清蛋白浓度与500nm波长处吸光度的标准曲线，运用Excel软件进行线性回归拟合，得到线性回归方程为y=1.2995x+0.0588，相关系数R2=0.9990，相关性良好。

1.3.6 分子质量的测定

采用不连续SDS-PAGE[19-20]，分离胶质量分数为18%，浓缩胶质量分数为5%，电极缓冲液含0.5mol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸(电泳级，pH8.3)，0.1% SDS(pH8.3)。电泳用样品溶解液(含2% SDS、5%巯基乙醇、10%甘油、0.02%溴酚蓝及浓度为0.05mol/L、pH6.8的Tris-HCl缓冲液)上样量为10μL，开始电泳时电压为100V，待样品进入分离胶后改为120V，使用考马斯亮蓝染色液进行染色。

1.3.7F值的测定

根据玉米肽的氨基酸组成，分别计算支链氨基酸总量及芳香族氨基酸总量，并按式(2)计算F值。

2 结果与分析

2.1 Alcalase 2.4L蛋白酶酶解条件的优化

2.1.1 微波时间对多肽得率的影响

图1 微波时间对多肽得率的影响Fig.1 Effect of microwave treatment time on the yield of polypeptide

微波热效应方式与传统的水浴加热明显不同，是通过高频变化的电场使分子内部极性分子进行剧烈的运动，产热快、升温快，极短时间即可达到酶解反应温度。由图1可知，以160mL水为溶剂，在微波功率为300W的条件下，微波时间为1.5～2.5min时，多肽得率随着时间的延长而增加，当微波时间为2.5min时，多肽得率达到最大值，超过2.5min时，多肽得率随着时间的延长而降低。微波时间过短，体系不能达到酶解作用的最适温度，使得酶对玉米蛋白粉的降解作用不充分，导致玉米蛋白粉的水解度过低，影响多肽得率；微波时间太长，反应体系温度过高，导致部分酶失活，同样使得玉米蛋白粉的水解度过低，影响多肽得率。

2.1.2 酶添加量对多肽得率的影响

由图2可知，当酶添加量为3g/100g 时多肽得率达到最大值，此时玉米蛋白粉的水解度达到最大，多肽得率最高。但随着酶添加量的增加，多肽得率不再增加，甚至出现了小幅度降低。目前在微波环境下酶对底物的作用机理尚不明确，可能由于酶含有极性基团，过多的酶在微波场的高频振荡作用下，产生热作用和机械作用，使酶的结构发生变化而失活，进而使得多肽的得率有所降低。

图2 酶添加量对多肽得率的影响Fig.2 Effect of alcalase amount on the yield of polypeptide

2.1.3 底物含量对多肽得率的影响

图3 底物含量对多肽得率的影响Fig.3 Effect of substrate concentration on the yield of polypeptide

由图3可知，底物含量为7、8、9g/100g时，酶解上清液中的多肽得率均为最大值，当底物含量继续增大时，由于玉米蛋白粉的含量增多，使得玉米蛋白粉不能全部与酶的活性中心充分结合，造成了底物浪费，降低了酶解效率，导致多肽的得率降低。而当底物含量逐渐降低时，多肽得率没有变化，但从溶剂的角度考虑，相同量的溶剂处理的玉米蛋白粉相应减少，造成了溶剂浪费，因此以9g/100g作为酶解反应的最佳底物含量。

2.1.4 pH值对多肽得率的影响

图4 pH值对多肽得率的影响Fig.4 Effect of pH on the yield of polypeptide

由图4可知，在pH值为9.0～9.5时，酶解上清液中的多肽得率达到了最大值，pH值过高或过低都将影响酶的活性，影响酶解效率。

2.1.5 Alcalase 2.4L蛋白酶酶解条件的正交试验设计

在单因素试验的基础上，对影响多肽得率的4个因素微波时间、底物含量、酶添加量、pH值进行L9(34)正交试验，确定最佳的酶解条件。由表1可知，各因素对微波酶解效果影响程度的大小顺序为C＞D＞A＞B，最佳工艺条件为A1B3C3D2。经实验验证，A1B3C3D2组合条件下制备玉米肽得率为22.73g/100g CGM，低于表1中7号试验结果，所以选择7号A3B1C3D2为最佳条件，即在微波功率300W、微波时间2.5min、酶添加量3g/100g、底物含量9g/100g、pH9.0，按此条件微波酶解上清液中多肽得率最高为23.80g/100g CGM。

表1 Alcalase 2.4L蛋白酶酶解条件优化正交试验结果分析Table 1 Result analysis of orthogonal tests for optimizing alcalase hydrolysis conditions

2.1.6 Alcalase 2.4L蛋白酶酶解条件正交试验结果的方差分析

表2 Alcalase 2.4L蛋白酶酶解正交试验结果方差分析Table 2 Variance analysis for orthogonal tests for optimizing alcalase hydrolysis conditions

由表2可知，pH值和微波时间对多肽得率的影响极显著(P＜0.01)，底物含量与酶添加量对多肽得率的影响显著(P＜0.05)。

2.2 木瓜蛋白酶酶解的条件优化

2.2.1 微波时间对耗碱量的影响

由图5可知，取60mL酶解上清液，在100W功率条件下，微波时间为3.5～5.0min时，耗碱量随着时间的延长而增加，当微波时间为5.0min时，耗碱量达到最大值，当时间大于5.0min时，耗碱量随着时间的延长而降低。微波时间太短，体系能量过低，不能达到酶的最适温度，导致多肽与木瓜蛋白酶的作用不充分，影响酶解效率；而微波时间太长，则导致体系能量过高，部分酶分子失活。因此，木瓜蛋白酶的最佳微波辅助酶解时间为5.0min。

图5 微波时间对耗碱量的影响Fig.5 Effect of microwave treatment time on the consumption of alkali

2.2.2 酶添加量对耗碱量的影响

图6 酶添加量对耗碱量的影响Fig.6 Effect of papain addition amount on the consumption of alkali

由图6可知，随着酶添加量增加，耗碱量逐渐增加，当酶添加量超过4g/100g后，随着酶添加量的增加耗碱量变化不明显。故木瓜蛋白酶最佳的酶添加量为4g/100g。

2.2.3 pH值对耗碱量的影响

图7 pH值对耗碱量的影响Fig.7 Effect of pH on the consumption of alkali

由图7可知，pH值为7.5时，耗碱量达到最大值， pH值过高或过低都将严重影响酶的活性，影响酶解效率。故使用木瓜蛋白酶进行酶解的最佳pH值为7.5。

2.2.4 木瓜蛋白酶酶解条件的正交试验设计

表3 木瓜蛋白酶酶解条件优化正交试验结果分析Table 3 Result analysis of orthogonal tests for optimizing papain hydrolysis conditions

在单因素试验的基础上，对影响耗碱量的3个因素微波时间、酶添加量、pH值进行L9(34)正交试验，确定最佳的酶解条件，由表3可知，对木瓜蛋白酶微波酶解效果影响程度大小顺序为A＞B＞C，最佳工艺条件为A3B3C3。而正交表中最佳试验号为6号，进行A3B3C3验证重复实验，得此条件下耗碱量为6.23mL/100mL，与6号试验A2B3C1相比无明显优势，且消耗更多碱与酶，增加成本，因此本研究采用较经济的条件A2B3C1，即酶添加量4%、pH7.5、微波功率100W、微波时间5min，此条件下耗碱量最大。

2.2.5 木瓜蛋白酶酶解条件正交试验结果的方差分析

表4 木瓜蛋白酶酶解条件正交试验结果方差分析Table 4 Variance analysis for orthogonal tests for optimizing papain hydrolysis conditions

由表4可知，pH值对耗碱量的影响极显著(P＜0.01)，微波时间与酶添加量对耗碱量的影响显著(P＜0.05)。

2.3 微波协同酶解与传统水浴酶解的比较

2.3.1 酶解时间的比较

表5 两种方法酶解时间的比较Table 5 Comparison of hydrolysis time for both methods

由表5可知，以Alcalase 2.4L蛋白酶进行传统水浴加热酶解时，反应60.0min后的多肽得率与在微波协同酶解反应2.5min后的得率相近，未有明显升高。以木瓜蛋白酶进行酶解时间40min后的耗碱量为6.25mL/100mL，与微波协同酶解5min后的耗碱量相近。因此使用微波协同酶解方法对玉米蛋白粉进行酶解，反应时间明显缩短，大大降低了反应的能耗，同时还能保证酶解效率，是一种节能而高效的新型酶解方法。

2.3.2 氨基酸组成的比较

图8 水浴酶解后多肽的氨基酸图谱Fig.8 Amino acid profile of corn peptide prepared by traditional water-bath enzymatic hydrolysis

图9 微波协同酶解后多肽的氨基酸图谱Fig.9 Amino acid profile of corn peptide prepared by microwaveassisted enzymatic hydrolysis

按照GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》计算氨基酸的含量，结果见表6。

表6 多肽氨基酸组成的比较Table 6 Comparison of amino acid compositions in corn peptide

对比两种方法制得的玉米肽的氨基酸组成，可以看出，微波协同酶解后玉米肽F值较传统水浴酶解后F值提高4.71，增加幅度达21%。

2.4 高F值玉米肽SDS-PAGE电泳图谱

图10 玉米肽的SDS-PAGE电泳Fig.10 SDS-PAGE of corn peptide

由图10中的谱带可知，在本研究条件下，采用微波辅助复合酶法制取的高F值玉米肽分子质量为6～10kD。欲获得更小分子质量的短肽，还需进一步探索相应的实验条件。

3 结 论

采用微波协同酶解方法制取高F值玉米肽，进行分步酶解，第一次酶解：Alcalase 2.4L蛋白酶最佳酶解条件为底物含量9g/100g、酶添加量3g/100g、pH9.0、微波功率300W、微波时间2.5min，按此条件酶解多肽得率23.80g/100g CGM。第二次酶解：木瓜蛋白酶酶解的最佳条件为酶添加量4g/100g、pH7.5、微波功率100W、微波时间5min，按此条件进行酶解，耗碱量为6.22mL/100mL。使用微波协同酶法所制取的玉米肽F值为27.15，比传统的水浴酶法提高了21%，且极大地缩短了反应时间，简便快捷，不但条件温和、容易控制、加快反应速率，同时大幅度提高产物的F值，具有较好的应用前景。

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