重离子束-紫外线复合诱变选育高产Lovastatin土曲霉菌株

宋红平，李 梅，冯 琳，安晓娟，李师翁*

(兰州交通大学化学与生物工程学院，甘肃 兰州 730070)

Lovastatin是1979年Endo[1]从红曲霉(Monascus ruber)的培养液中分离出的一种能够强力抑制胆固醇合成的生物活性物质，已知其主要产生菌有Monascus ruber、Aspergillus terreus、Penicillium citrinum等。Lovastatin的主要作用是在体内竞争性的抑制胆固醇合成的限速酶3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA，HMG-CoA)的活性，从而阻断内源性胆固醇的合成，使胆固醇的合成大大减少[2]。Lovastatin具有多重的药理作用，对多种慢性疾病有显著疗效，如代谢性综合症、多种位点专一性癌变、骨质疏松、老年性痴呆、帕金森症、多种组织硬化和风湿性关节炎等[3]。

目前，诱变育种是工业微生物菌种选育的有效方法，常见的诱变方法有物理诱变、化学诱变、空间技术诱变和复合诱变等。紫外线诱变主要原理是使DNA分子形成嘧啶二聚体，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而引起突变碱基转换(conversion)、颠换(transversions)、移码突变(frameshift mutations)或缺失(deletions)等，靳建忠等[4]利用紫外线诱变出芽短梗霉选出高产普鲁兰糖白化突变菌株。紫外线与物理、化学方法复合诱变已广泛应用于微生物育种中，周波等[5]利用紫外线与化学诱变剂复合诱变筛选出一株高产红曲黄色素菌株。重离子束作为一种新的辐射诱变育种源，在新品种选育中具有重要的独特应用效果。重离子束可导致水稻的miRNA和特异性miRNAs发生改变，通过基因表达显示出不同的性状[6]。本实验室利用兰州重离子加速器重离子装置产生的重离子束对A.terreusCA99的孢子进行了辐照，结果发现重离子束能使土曲霉孢子发生变异。为了进一步提高Lovastatin的产量，本实验在前面实验的基础上，以菌株A.terreusCA99为出发菌株，用重离子束和紫外复合诱变的方法对A.terreusCA99进行诱变，以期获得高产Lovastatin菌株。

1 材料与方法

1.1 出发菌株

土曲霉(Aspergillus terreusCA99)，由中国农业大学微生物生理研究室提供。

1.2 培养基

斜面/平板培养基为PDA培养基；种子培养基(g/L)：葡萄糖50、玉米粉10、氯化钠2、磷酸二氢钾0.5、硫酸镁0.5，pH值自然；发酵培养基(g/L)：玉米粉10、氯化钠2、硝酸钠2、磷酸二氢钾0.5、硫酸镁0.5，甘油30mL，pH值自然。

1.3 孢子悬液的制备

将菌株CA99在PDA培养基上30℃活化培养5～6d，用无菌水冲洗菌种斜面, 移入三角瓶中，并加入1～2滴0.02%的Triton X-100及玻璃珠，180r/min振荡1h，4层无菌滤纸过滤，在血球计数板下计数，制成1×106个/mL的孢子悬液。

1.4 重离子束诱变

重离子束诱变在中国科学院近代物理研究所兰州重离子研究装置(HIRFL)上进行。以40mm能量为80MeV/u12C6+重离子束垂直辐照孢子悬液，剂量分别为5、10、15、20、25、30Gy，每个剂量设置3个平行，剂量数据获取及样品更换由计算机控制[7]。将重离子束诱变处理过的孢子悬液稀释至10-3和10-4，吸取100μL涂布于PDA平板培养基上，每一稀释倍数设置3个平行，以未诱变的孢子悬液为对照，30℃避光培养5d，计算致死率。

1.5 紫外线诱变

将重离子诱变筛选得到的高产菌株制备孢子悬液，无菌超净工作台中吸取孢子悬浮液5mL于带磁力搅拌子的平皿中，打开皿盖，置于磁力搅拌器上，15W紫外灯垂直距离15cm处，磁力搅拌下照射时间分别为30、60、90、120、150、180s。将紫外线照射后的孢子悬液稀释至10-3和10-4，吸取100μL涂布于PDA平板培养基上，每个稀释倍数设置3个平行，以未诱变的孢子悬液为对照，30℃避光培养5d，计算致死率。

1.6 诱变菌株的初筛和复筛

将经过辐照处理的孢子悬液稀释至10-3和10-4，吸取100μL涂布在固体平板培养基上，每个稀释度涂布3个平皿，在30℃的恒温培养箱中培养3～4d，挑取生长较快的单菌落接入试管斜面培养基保存。将初筛得到的菌株接入20mL液体种子培养基中，30℃摇瓶培养24h，再以10%的接种量接入50mL液体发酵培养基中，30℃、150r/min摇瓶培养15d，测定发酵液中Lovastatin的含量，筛选产量高的菌株。

1.7 Lovastatin产量的测定

1.7.1 定性分析

薄层层析法：将摇床培养15d的菌株发酵液经超声波和乙酸乙酯提取后，再经过柱层析分离，提取纯化后的Lovastatin样品和标准品一起进行硅胶薄层层析，再经过磷钼酸染色后观察斑点的位置和大小。紫外分光光度法：将提纯后的Lovastatin样品用75%乙醇溶解后，以75%的乙醇为对照，用紫外分光光度计进行扫描，扫描波长范围226～260nm。如果在231、238、246nm波长附近有最大吸光度，表明有Lovastatin存在。红外光谱法：将Lovastatin标准品和突变A.terreusUV150-3发酵液提取获得的Lovastatin样品，分别用KBr压片后用红外光谱分析仪VERTEX 70进行红外光谱检测。

1.7.2 定量测定

按照文献[7]方法进行，采用双波长紫外分光光度法，排除样品中色素的干扰，在246nm和254nm双波长处快速测定发酵液中Lovastatin的含量。

2 结果与分析

2.1 重离子束诱变结果

图1 重离子照射对A.terreus CA99孢子的致死率Fig.1 Effect of heavy-ion irradiation on the spores survival of A.terreus CA99

由图1可知，重离子束辐照强烈影响A.terreusCA99孢子的生活力，致死率随辐照剂量的增加而增加，辐照剂量大于20Gy时，致死率增加的速度减缓，30Gy时致死率达99.9%。通常情况下，将存活率大于30% (致死率大于70%)的辐照剂量，作为诱变育株的参考剂量，重离子对土曲霉的致死率在70%以上的有效致死剂量在15～30Gy。

图2 重离子辐照后初筛的16株菌株的Lovastatin产量Fig.2 Lovastatin yields of 16 strains screened by heavy-ion irradiation

由图2可知，重离子束辐照后的孢子经过初筛得到的16株菌株，通过液体摇瓶发酵复筛，得到7株Lovastatin产量高于出发菌株A.terreusCA99的诱变菌株，产量明显提高的是A.terreusZ30-3、A.terreusZ15-6、A.terreusZ15-7和A.terreusZ15-9，其中A.terreusZ15-9的产量最高，为735.00mg/L，是出发菌株(171.20mg/L)的4.29倍。因此，将A.terreusZ15-9进行下一步的紫外诱变。

2.2 紫外线诱变结果

图3 紫外线照射时间对A.terreus Z15-9孢子的致死率Fig.3 Effect of ultraviolet irradiation time on the spores survival of A.terreus Z15-9

由图3可知，紫外线对菌株的致死率与照射强度和照射时间有关。在15W紫外灯垂直距离15cm处照射，随着紫外线照射时间的延长，菌株A.terreusZ15-9的致死率不断增大，照射时间在100～180s范围内，A.terreusZ15-9的致死率都大于80%，表明在此时间范围进行辐照，诱变效果更好。

图4 紫外线诱变后初筛得到的19株菌株的LovastatinFig.4 Lovastatin yields of 19 mutants screened by ultraviolet radiation

由图4可知，紫外线照射后经初筛得到19株菌株，通过摇瓶发酵进行复筛，得到3株产Lovastatin产量高于出发菌株A.terreusZ15-9诱变株，分别是A.terreusUV150-1、A.terreusUV150-3、A.terreusUV150-4，其中A.terreusUV150-3菌株的Lovastatin产量最高，为966.32mg/L是A.terreusZ15-9菌株(735.00mg/L)的1.31倍。因此，将A.terreusUV150-3作为最终菌株进行进一步研究。

将重离子诱变和紫外诱变后的菌株A.terreusUV150-3接种于PDA平板培养基中，培养5～6d后，有大量的土黄色的孢子产生，诱变后菌落生长较快，外周有大量白色菌丝产生。用接种针从斜面或发酵液中挑取少量菌丝，制作菌丝装片，在显微镜下观察，A.terreus的菌丝分支较多，为有隔菌丝，其内含物及孢子呈浅绿色，具典型的分生孢子梗。诱变后的菌株相比原菌株菌丝变细，内含物排列不规整，孢子和孢子梗的形态没有发生变化。

2.3 A.terreus UV150-3菌株的液态培养特性

将A.terreusUV150-3菌株接种到发酵培养基中，进行液态摇瓶发酵，菌丝团成球状，在发酵前3d左右菌球呈白色，整个发酵液呈淡绿色，随着培养时间的延长，发酵液颜色逐渐变深，菌丝球也越来越大。发酵结束后，整个发酵液呈现土黄色略带红色。研究表明Lovastatin的生物合成与菌丝球的结构和大小有一定关系，紧凑的菌形和小菌丝球更有利于其合成，同时在繁殖期生物量也达到最高，最适菌丝球大小直径在0.85～1.05mm之间，这与Lai等[8]的研究结果一致。Bizukojc等[9]研究发现当土曲霉孢子的菌落直径小于1.5mm的菌丝球可以使Lovastatin的产量达到最大，孢子数量小于2×109个时生物量达到最大。

图5 A.terreus UV150-3的生长曲线Fig.5 Growth curve of A.terreus UV150-3

由图5可知，将A.terreusUV150-3接种于发酵培养基中，前3d每隔24h测定其生物量，之后每隔3d测定1次，并用双波长紫外分光光度法测定其Lovastatin产量。菌株A.terreusUV150-3在前6d生长较快，9d以后菌株生长进入稳定期。

图6 A.terreus UV150-3的产物曲线Fig.6 Lovastatin production of A.terreus UV150-3

由图6可知，前6d Lovastatin产量较低，这一阶段主要是菌株自身的生长，随着培养时间的延长，发酵液中Lovastatin的产量也逐渐增加，当达到15d后，Lovastatin产量趋于稳定，造成此现象的原因是发酵培养基中的养分已被消耗，菌体代谢产物逐渐增多。文献报道[10-12]中，土曲霉发酵产Lovastatin的最佳发酵时间在10d左右，本实验中最佳发酵时间为15d。

2.4 A.terreus UV150-3发酵液中Lovastatin的定性分析

图7 Lovastatin样品与标准品的薄层层析Fig.7 Thin layer chromatography of lovastatin standard and lovastatin samples

图8 Lovastatin样品的紫外扫描图谱(75%乙醇)Fig.8 UV spectrum of lovastatin sample (in 75% ethanol)

从图7薄层层析图可以看出，与标准品有相同位移的洗脱液表明有Lovastatin的存在。由图8紫外扫描可看出，用75%乙醇溶解经柱层析得到的Lovastatin样品，在230、238nm和246nm处有3个紫外吸收峰，这与文献报道[13]的用紫外检测Lovastatin在229、237nm和246nm波长处有最大吸收峰相同。Lovastatin的红外光谱在3550、2970、1696cm-1和1220cm-1处有特征吸收峰[13]，本实验在室温下用溴化钾压片法测定Lovastatin样品和标准品的红外光谱(图9)，A.terreusUV150-3菌株产生的Lovastatin样品的红外光谱特征吸收峰为3539.98、2928.53、1700.37、1219.63cm-1，与标准Lovastatin特征吸收峰3540.63、2965.37、1699.64、1220.01cm-1一致。因此，通过薄层层析、紫外扫描图谱及红外图谱可以得出A.terreusUV150-3菌株的发酵液中含有Lovastatin。

图9 Lovastatin样品与标准品的红外吸收光谱Fig.9 IR spectra of lovastatin samples and lovastatin standard (KBr)

2.5 A.terreus UV150-3的遗传稳定性

为了考察诱变菌株的遗传稳定性，对菌株A.terreusUV150-3连续传代培养5代，每代进行摇瓶发酵，并重复3次测定Lovastatin的产量及生物量。由表1可知，培养5代A.terreusUV150-3发酵液中Lovastatin的产量稳定在960mg/L左右，生物量也比较稳定，说明菌株A.terreusUV150-3有较好的遗传稳定性。

表1 A.terreus UV150-3产Lovastatin遗传稳定性(±s, n＝3)Table 1 Genetic stability of A.terreus UV150-3 (±s, n＝3)

表1 A.terreus UV150-3产Lovastatin遗传稳定性(±s, n＝3)Table 1 Genetic stability of A.terreus UV150-3 (±s, n＝3)

指标 传代次数1 2 3 4 5 Lovaststin产量/(mg/L)生物量/(g/100mL)966.32±5.11 0.639±0.009 970.12±7.03 0.640±0.010 953.35±10.33 0.647±0.013 962.90±9.80 0.644±0.007 959.20±2.34 0.645±0.004

3 讨论与结论

目前，产Lovastatin的丝状真菌有Monascus、Aspergillus和Penicillium等，其中以Monascus ruber、Monascus pilosus、Aspergillus terreus、Aspergillus flavipes等广泛用于研究和生产。但Lovastatin的野生菌株一般产量都很低，因此运用诱变育种的方法来获得优良菌株的研究越来越受到重视，并取得了一定的研究结果[14]。蒋世春[15]用微波等离子体(N+20W)诱变方法，筛选到一株最高产率为对照菌株的118.7%的高产菌株N-28，并进行传代产量稳定性实验，经发酵工艺条件优化，在培养过程中改变碳氮比例，添加适量的甲硫氨酸，最终Lovastatin的产率提高21.8%。陈芝等[16]将高产Lovastatin的A.terreus与低产的M.anka进行原生质体融合，筛选得到高产的融合子。近年来，基因工程技术的应用，大大提高了微生物菌种的选育的效率。但传统的物理化学诱变方法，因其具有简单、快速、有效等优点，至今仍被广泛使用。本研究采用重离子和紫外线复合诱变的方法，对Aspergillus terreusCA99，通过初筛复筛选出了一株高产Lovastatin菌株A.terreusUV150-3，其产量高达966.32mg/L，较原始出发菌株A.terreusCA99 (171.20mg/L)提高了4.6倍，且遗传稳定性良好。

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