嗜热链球菌中CRISPR序列的检测与同源性分析

邓凯波，霍贵成*

(东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030)

自古以来，乳酸菌就是人们广泛使用的一类益生菌。现代工业中，益生菌发酵制品种类繁多，很多乳酸菌被用作发酵剂应用于工业生产，其中嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)为应用最广泛的乳酸菌之一。然而，由于噬菌体污染而导致的生产失败已造成了重大的经济损失。尽管研究者们已采取了许多手段[1]，但收效甚微。

规律成簇的间隔回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)以“重复序列-间隔区(repeat-spacer)”为单元组成了原核生物基因组上的一段非编码区，是专门针对噬菌体及质粒等外源基因的获得性免疫系统[2-4]。CRISPR序列的典型结构为21～48bp的重复序列和其间插入的相似长度的非重复间隔序列组成[2]。目前，嗜热链球菌CRISPR序列结构和作用机理方面的研究仅在Streptococcus thermophilusDGCC 7710中最为详尽[5-9]，我国尚无相关报导。探明我国嗜热链球菌中的CRISPR序列结构，对其进化研究以及今后噬菌体抗性突变菌株的构建都具有重大意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

8株嗜热链球菌(S.thermophilus)S0、S4、S06、S07、S14、S18、St和SM由KLDS-DICC保藏；E.coliDH5α为实验室保存。pMD18-T载体、限制性内切酶EcoRI、PCR体系中的GC bufferⅠ、LA Taq扩增酶 日本TaKaRa公司；细菌基因组提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司。

GM17培养基：蛋白胨5.0g、酵母提取物5.0g、胰蛋白胨5.0g、抗坏血酸0.5g、牛肉浸膏2.5g、β-甘油磷酸二钠19g、琼脂15g，1.0mol/L MgSO4·7H2O 1.0mL，蒸馏水定容至1L，118℃灭菌20min。固体GM17培养基另添加质量分数为1.5%的琼脂。

LB培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，用蒸馏水定容至1L，调至pH 7.0，118℃条件下灭菌20min。固体LB培养基另添加1.5%的琼脂。

氨苄霉素LB培养基(LB-Amp+)：LB培养基配制灭菌后，温度降至55℃左右，添加终质量浓度为100μg/mL的氨苄霉素，摇匀后使用。

1.2 仪器与设备

580BR 5360型梯度PCR仪 美国伯乐公司；9700 PCR System 美国ABI公司；DYY-10C电泳仪 北京六一仪器厂；UVP凝胶成像系统 美国UVP公司。

1.3 方法

1.3.1 嗜热链球菌CRISPR序列引物设计

根据CRISPR database(http∶//crispr.u-psud.fr/crispr/)公布的S.thermophilusLMD-9全序列菌株的3个CRISPR序列信息设计3对引物分别为：P1(正向引物：5’-GAATCACTATGTGGGTATG-3’，反向引物：5’-TTCAGGTGTTTACGGACT-3’)、P2(正向引物：5’-CTTTAGGGTAATGGCGTGAGGGTG-3’，反向引物：5’-ACTTTCTGGAAGCGGTGGCAATAA-3’)和P3(正向引物：5’-GAGGCTACCTGAATAATCCGACC-3’，反向引物：5’-GGCTCTGTATGAAGTTGAATGGG-3’)，引物设计采用Primer premier 5软件。

1.3.2 引物退火温度确定

采用梯度PCR方法对3对引物的退火温度进行摸索，采用小剂量扩增体系，分别以S0、St和SM基因组DNA为模板，根据电泳结果确定最佳退火温度。

1.3.3 CRISPR序列扩增

3对引物分别对供试菌株基因组进行CRISPR序列扩增，反应缓冲液采用GC bufferⅠ，扩增酶为LA Taq，并采用最佳退火温度，电泳鉴定结果。

1.3.4 CRISPR序列片段连接转化和鉴定

回收得到目的片段与pMD18-T载体连接后，转化入感受态细胞E.coliDH5α。对阳性菌落进行质粒提取，并用限制性内切酶EcoRI进行酶切鉴定，对目的片段测序。

1.3.5 CRISPR序列BLAST比对和同源性分析

测序结果用BLAST CRISPR进行基因同源性比对，得到并构建出该菌株的CRISPR序列结构，以及重复序列(DR)和间隔区序列(spacer)。并将得到的CRISPR序列与标准菌株CRISPR序列进行多重序列比对。

1.3.6 重复序列二级结构预测

采用CLC sequence viewer 6对供试菌株与标准菌株的DR进行多重比对，并对结果进行DNA sequence logo(http∶//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)作图，并采用RNAfold web server (http∶//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)预测序列的二级结构。

2 结果与分析

2.1 引物退火温度确定

分别用P1、P2和P3对S.thermophilusS14、St和SM基因组进行梯度扩增，对退火温度梯度设定，结果如图1所示。

图1 3对引物温度梯度PCR扩增产物电泳图Fig.1 Agarose gel pattern of gradient PCR products by three pairs of primers

由图1可知，3对引物的扩增产物效率均随着温度有递增或递减变化，确定P1、P2和P3的退火温度范围可分别在52.3～62.0℃、50.0～59.6℃和50.0～54.4℃，据此确定3对引物最佳退火温度均为52.3℃。

2.2 CRISPR序列的扩增与测序

按照最佳退火温度，分别用P1、P2和P3对8株供试嗜热链球菌的CRISPR序列进行扩增，产物电泳结果见图2，CRISPR详细信息见表1。

表1 嗜热链球菌CRISPR信息Table 1 Information of Streptococcus thermophilus CRISPR

图2 CRISPR序列扩增电泳图Fig.2 Agarose gel pattern of CRISPR amplification

由图2和表1可知，在所有供试菌株的CRISPR扩增中，只有S4在以P2和P3为引物的条件下无扩增结果，说明在此菌株中不存在该两段序列，其他得到理想的扩增结果经测序和CRISPR Finder分析后，均鉴定为CRISPR序列，存在率达到100%，远高于CRISPR database公布的在细菌范围内的比例(46.4%，截止至2011年10月)。CRISPR最短仅为101bp，存在1个Spacer(S0和S6)；最长为2853bp，其中包含43个Spacer(S4)。对于8株供试菌株，3对引物对应的CRISPR中DR序列相同，大小为30～38bp，但其DR-Spacer单元的数量并不一致。CRISPR在一定程度上可反应出细菌的进化历程[10]，这种现象也许是由于菌株生长环境不同造成的序列差异的结果。

将P1、P2和P3相对应的DR序列分别命名为：DR1(5’-GATATAAACCTAATTACCTCGAGAGGGGACGGA AAC-3’)、DR2(5’-GTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGT AACTGTACAAC-3’)和DR3(5’-GTTTTAGAGCTGTGTT GTTTCGAATGGTTCCAAAAC-3’)。

2.3 DR序列同源性比较

分别对这3种DR进行BLAST同源性比对(E值＜0.1)，结果见表2。DR1～DR3的高同源性(E值＜0.1)的菌株均为乳球菌属，这与其菌属亲缘关系具有一定的一致性；其中DR1高同源性菌株仅4株，其中前3株均与供试菌株同种，且同源性为100%；与DR2同源性100%菌株除嗜热链球菌外，有一株为S.gordoniistr.Challissubstr.CH1，另外还有若干S.thermophilusDGCC7710的突变体分离株(*号)；这一现象在DR3中更为明显，而同为嗜热链球菌的S.thermophilusCNRZ1066和S.thermophilusLMG 18311，其同源性却相对较低。这种同种不同源，同源却不同种的现象已在多种细菌的CRISPRs序列中发现[11-15]，研究者们将这种现象称为水平基因转移(HGT)，与基因转座类似，这种机制也许能增强菌株的环境适应力和功能基因的传播。

表2 CRISPRDR同源性比对结果Table 2 Homology alignment of CRISPR DR

2.4 重复序列二级结构预测

重复序列比对和二级结构预测结果如图3～5所示。其中二级结构的预测均采用中心二级结构法(centroid secondary structures)，并记录形成结构的最小自由能(kcal/mol)。

图3 DR1高同源性序列多重比对及二级结构预测Fig.3 Multiple alignment and second structure prediction of DR1 with high homology

图4 DR2高同源性序列多重比对及二级结构预测Fig.4 Multiple alignment and second structure prediction of DR2 with high homology

图5 DR3高同源性序列多重比对及二级结构预测Fig.5 Multiple alignment and second structure prediction of DR3 with high homology

由图3～5可知，DR1～DR3的高同源群一致序列均为36bp，可形成类似发夹环的二级结构。其中，DR1(图3c)环头部仅为6碱基组成，茎区长4碱基；而2DR(图4c)头部为21碱基形成的大环，茎区为6碱基。对于头部大小对DR功能的影响尚无报道。尾部差异也比较大，其中，DR1(图3c)尾部长达16和8碱基，DR2(图4c)适中，为4和1碱基，而DR3(图5c)除头部外，按照最小自由能原则，均形成了茎区，尾部没有游离碱基。各图b中，重复结构一致序列的碱基互补配对，对其进行二级结构预测可知，均形成了发夹环结构(图3c、4c、5c)。3个高同源群二级结构的最小自由能分别为：DR1群：－7.10kcal/mol；DR2群：－3.71kcal/mol；DR3群：－4.60kcal/mol。

据推测，回文结构可能与新Spacer的效率有关。新增间隔区通常会插入CRISPR前导序列与第一个DR之间[5,16]。在内切酶将切口打开后，较大的游离尾巴显然会对Spacer的插入比较有利。这一推测很可能影响到CRISPR对外源染色体的抵抗作用。

3 结 论

8株供试嗜热链球菌均检测出CRISPR序列，其中S4具有1条，其余7株均含有3条，并整理出3类DR序列，长度为30～38bp。另外3类DR均可形成回文结构，体现了CRISPR结构的特殊性，茎区长度与碱基可能与Spacer的插入有关；DR与个别远缘种的高同源性表明其存在水平基因转移现象，并可能与16S rDNA相比经历了相对不同的进化途径。CRISPR序列的检测将对今后针对我国野生嗜热链球菌噬菌体抗性菌株的开发提供基础平台，且由于CRISPR抗噬菌体作用方式为食品级安全，所以对其广泛应用于生产中是非常有利的。

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