金花茶多糖单一成分的化学结构特征解析

林华娟，田晓春，秦小明，路 垚，杨基柱

(1.广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088；2.广西桂人堂金花茶产业集团股份有限公司，广西 防城港 538021)

金花茶(Camellia chrysantha(Hu)Tuyama)，山茶科、山茶属、金花茶组植物，是广西防城港一带的珍贵茶叶之一，2010年被批准为新资源食品。由于其独特的金黄花色和生理活性功能，近年来受到许多学者和消费者的关注，并被誉为植物界“大熊猫”。许多研究结果表明金花茶提取物具有抗氧化[1]、降血脂[2-3]、抑制肿瘤生长[4-6]等多种生理功能，但是其功效关系尚不清楚，其中金花茶多糖被认为是重要的功能因子之一。动物实验[3]研究结果显示，金花茶粗多糖具有明显的降血脂作用。讲述研究对金花茶多糖的理化性质进行了初步研究，并采用Cellulose DE-52离子交换柱层析对金花茶多糖进行分离纯化，分别得到了TPS0、TPS1、TPS2、TPS3、TPS4和TPS5等6个多糖组分。前3个组分以中性糖为主，后3个组分以半乳糖醛酸为主。另外，前3个组分中未检测出鼠李糖，而后3个组分则含有约11%的鼠李糖，由此推测后3个组分的糖分子很可能是由以鼠李糖-半乳糖醛酸交替连接而成的毛发区域和由n个半乳糖醛酸连接而成的平滑区域等两大片段组成。但是其化学结构尚不清楚[7]。

对于果胶物质，目前比较公认其分子主要是由毛发区域和由平滑区域等两大区域组成。对于毛发区域，其主链是由→4)-α-D-GalpA-(1→2)-α-L-Rhap-(1→为基本单位的重复交替分子链，主链上的鼠李糖往往会连接以阿拉伯糖、半乳糖为主的中性糖支链，分子形状像毛发一样因此得名毛发区域。对于平滑区域，其主链是由n个半乳糖醛酸通过α-1,4键结合而成的半乳糖醛酸聚糖。另外，果胶物质分子上的半乳糖醛酸往往会有不同程度的甲酯或乙酯化。果胶物质之间的化学结构差异主要体现在毛发区域的微细化学结构、平滑区域分子片段的大小以及酯化程度[8]。为了进一步研究金花茶多糖的化学结构特征，本研究以得率最高的TPS3为对象，对其进行进一步分离纯化获得均一性好的多糖单一成分，然后通过红外光谱分析、核磁共振分析以及阶梯式部分酸水解分析等手段对其毛发区域的化学结构特征进行深入分析，旨在为金花茶多糖的构效关系研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

本研究所用的TPS3多糖组分是以金花茶提取浓缩液(广西桂人堂金花茶产业集团股份有限公司产品)为材料，按照参考文献[2]，经过乙醇沉淀、透析以及离子交换层析柱等方法分离而成。

葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸 日本和光纯药公司；凝胶柱层析树脂Sephacryl S-200以及Dextran系列标准物质(T-500：4.87×105u；T-40：4.35×104u；T-20：2.00×104u；T-10,1.05×104u) 瑞典Pharmacia Fine Chemicals公司；牛血清蛋白 美国Sigma公司。

GC-14C气相色谱(GC)仪、LC-20AT高效液相色谱仪、RID-10A示差检测器 日本岛津公司；Spectrun GX FT-IR红外光谱分析系统 美国Perkin Elmer公司；AVANCE Digital 400MHz 核磁共振系统 德国Bruker公司。

1.2 成分含量测定

总糖、半乳糖醛酸、甲氧基和蛋白质含量分别采用苯酚-硫酸法[9]、咔唑-硫酸法[10]、Wood法[11]和考马斯亮蓝法[12]测定，分别以葡萄糖、半乳糖醛酸、甲醇和牛血清蛋白作为标准物质，在同样的条件下测定并制作标准曲线，计算样品中各成分含量。

1.3 构成糖分析

糖样品经过酸加热完全水解(0.25mol/L H2SO4，100℃，16h)，或者不经过水解处理，按照Blakeney等[13]制备成各单糖的全乙酰化糖醇衍生物，然后进行气相色谱(GC)分析(岛津GC-14C，柱温210℃，N2流速30mL/min)，分离柱为岛津公司的毛细管柱DB-1(0.25mm× 30m)。

1.4 多糖的凝胶柱层析

采用Sephacryl S-200凝胶柱层析对多糖进行进一步分离纯化和纯度鉴定[14]。用0.1mol/L NaCl溶液充分平衡Sephacryl S-200(1.6cm×100cm)层析柱后，用相同溶剂溶解多糖组分并加到层析柱上，然后以相同溶剂，以0.5mL/min的流速进行洗脱，以每管3mL收集洗脱液，并采用苯酚-硫酸法和/或咔唑-硫酸法对洗脱液进行跟踪检测，绘制洗脱曲线图。

1.5 多糖的排阻高效液相色谱(SE-HPLC)分析

多糖的平均分子质量估算采用SE-HPLC进行分析。以系列Dextran (T-500：4.87×105u；T-40：4.35×104u；T-20：2.00×104u；T-10：1.05×104u) 为标准物质，在同等条件下进行分析，以标准物质分子质量的对数为纵坐标，以其在柱层析的分配系数为横坐标绘制标准曲线，根据标准曲线推算多糖的平均分子质量。HPLC系统由岛津LC-20AT，RID-10A示差检测器组成。色谱柱：Shodex SugarKS-804(8mm×300mm)；流动相：0.1mol/L NaCl溶液；流速：1mL/min；柱温：常温。

1.6 多糖的红外光谱(IR)分析

多糖的IR分析仪采用Perkin Elmer公司的Spectrun GX FT-IR红外光谱分析系统。样品采用KBr压片法进行测定。

1.7 多糖的核磁共振(NMR)分析

多糖的NMR分析采用AVANCE Digital 400MHz NMR系统进行分析。以水溶性TMS(3-trimethylsilyl-propionic-2,2,3,3-D4 acid, sodium salt)作为内标，多糖样品60mg用重水充分溶解，再以重水为溶剂在室温条件下进行1H-NMR和13C-NMR波谱分析。1H-NMR分析条件，外部静磁场：400.133MHz，波谱宽幅8012.82Hz；13C-NMR分析条件，外部静磁场：100.625MHz，波谱宽幅27100.27Hz。

1.8 多糖的阶梯式部分酸水解

采用阶梯式部分酸水解对多糖的毛发区域化学结构特征进行分析[14]。即先用低浓度的三氟乙酸溶液(0.01mol/L)溶解定量的多糖样品，置于90℃条件下水解2h，水解结束后冷却、加入两倍量的冷却乙醇进行分离沉淀，离心(4000r/min，10min)，得到上清液和沉淀多糖(即未被水解多糖)。以此类推，依次用更高浓度的三氟乙酸溶液(0.05、0.5、2mol/L)对前一个酸浓度水解得到的沉淀多糖在相同条件下进行水解。各酸浓度水解得到的上清液用于总糖含量测定和构成糖分析。

2 结果与分析

2.1 多糖单一成分的分离纯化及部分理化性质

如前所述，金花茶多糖经过Cellulose DE-52离子交换柱层析得到TPS0、TPS1、TPS2、TPS3、TPS4和TPS5等6个多糖组分[7]。本实验以得率最高的TPS3为对象，采用Sephacryl S-200凝胶层析对其进行进一步分离纯化。

图1 TPS3及其分离组分TPS3-1和TPS3-2在Sephacryl S-200凝胶层析柱上的洗脱曲线Fig.1 Elution prof ile of TPS3 and its fractions such as TPS3-1 and TPS3-2 on Sephacryl S-200 column

图1 a显示了多糖TPS3在Sephacryl S-200凝胶层析柱上的洗脱曲线。洗脱曲线形成了两个有交叉的糖峰(TPS3-1和TPS3-2)。从中性糖和半乳糖醛酸的检测曲线看，两组分的半乳糖醛酸比例也有明显差异，TPS3-1的半乳糖醛酸与中性糖比例明显低于TPS3-2，表明TPS3是由分子质量和糖组成均有明显差异的两个多糖组分组成。由此可见采用反复Sephacryl S-200凝胶柱层析的方法可以将TPS3-1和TPS3-2分离。因此本研究采用凝胶柱层析方法收集两个组分，然后对其进行分子均一性鉴定。图1b和图1c分别为TPS3-1和TPS3-2在同样凝胶柱上的洗脱曲线。TPS3-1峰对称而且尖锐，表明TPS3-1分子的均一性较好，可视为多糖单一成分。相比之下，TPS3-2的峰比较宽，而且对称性不好，表明其仍为一些分子质量有差异的糖组成。

表1 TPS3及其分离组分TPS3-1和TPS3-2的主要化学成分含量Table 1 Contents of chemical compositions of TPS3 and its fractions including TPS3-1 and TPS3-2

表1列出了TPS3及其分离组分TPS3-1和TPS3-2的主要化学成分含量。TPS3-1和TPS3-2的中性糖含量分别为53.60%和45.91%，半乳糖醛酸的含量分别为24.00%和35.98%。两糖组分的中性糖和半乳糖醛酸的质量比分别为2.2(53.6/24)和1.3(45.91/35.98)，TPS3-1的中性糖含量明显高于TPS3-2。从中性构成糖组成来看，TPS3含有少量的甘露糖，但是TPS3-1和TPS3-2已经检测不出，表明经过凝胶柱层析的进一步纯化后，除了TPS3-1和TPS3-2，还有其他少量的多糖杂质。对于TPS3、TPS3-1和TPS3-2，鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖的质量比分别为：1∶3.7∶2.8∶0.6、1∶4.2∶3.0∶0.4和1∶2.2∶2.0∶3.5。TPS3-1和TPS3-2的构成糖组成比例有明显差异，TPS3-1中的阿拉伯糖和半乳糖分别为TPS3-2的2倍和1.5倍，而TPS3-2中的葡萄糖则为TPS3-2的8.8倍。由此可见TPS3-1和TPS3-2不管在中性构成糖组成比例，还是在半乳糖醛酸比例上均有明显差异。以上结果表明，TPS3-1和TPS3-2是两种化学结构各异的多糖。从甲氧基比例来看，TPS3、TPS3-1和TPS3-2中半乳糖醛酸的甲氧基酯化程度分别为43.84%、62.58%和47.83%。TPS3-1的甲氧基酯化程度明显高于TPS3-2。根据酯化程度对果胶分类，将半乳糖醛酸的酯化程度高于50%的果胶称之为高甲氧基果胶，相反则称之为低甲氧基果胶。由此可以看出，TPS3-1属于高甲氧基果胶物质。从蛋白质含量比例看，TPS3、TPS3-1和TPS3-2的蛋白质含量分别为0.95%、0.28%和0.60%，表明TPS3-1和TPS3-2分子上连接有少量蛋白质。以上结果表明，TPS3-1为阿拉伯糖和半乳糖比例较高，聚半乳糖醛酸被高度酯化且含有少量蛋白质的果胶单一成分。TPS3-2为葡萄糖比例高，部分半乳糖醛酸被酯化，含有少量蛋白质，由分子质量各异的糖成分组成的果胶物质。鉴于以上结果，以下对TPS3-1的化学结构进行进一步分析。

2.2 TPS3-1的化学结构特征

图2 估算多糖平均分子质量的标准曲线Fig.2 Standard curve for the estimation of average molecular weight of polysaccharide

图2 为根据排阻高效液相色谱(SE-HPLC)分析得到的估算多糖平均分子质量标准曲线图，可以估算TPS3-1的相对分子质量为4.15×105u。

图3 TPS3-1的IR图谱Fig.3 Infrared spectra of TPS3-1

由于多糖化学结构复杂，难以从红外光谱中获取较多的有用信息，但是在低于1000cm-1领域，构成糖残基及其异头氢的的立体结构与变角振动吸收峰有密切相关。图3为TPS3-1的红外光扫描图谱，图谱中893.1cm-1和776.98cm-1处出现了两个吸收峰(图中a和b箭头所示)，前一个为β-构型的典型指纹吸收峰，后一个为半乳糖或甘露糖的典型指纹吸收峰[15]。鉴于前面的构成糖分析结果TPS3-1中未检出甘露糖，因此此吸收峰归属为半乳糖的指纹吸收峰。综合以上IR分析结果，推测TPS3-1分子中的半乳糖为β-构型糖。

图4为TPS3-1的1H-NMR和13C-NMR图谱。对于1H-NMR图谱，在低磁场领域，5.17～5.23δ及5.01～5.03δ处有明显的信号峰，前面的信号区域归属于中性糖残基的异头氢原子信号，后一个信号区域归属于半乳糖醛酸的异头氢信号[16-17]。在高磁场领域，1.18～1.23δ处出现了非常明显的信号，该区域信号可归属于甲氧基中的烷氢，表明TPS3-1中有较高比例的甲氧基，这个结果和化学测定结果非常一致。对于13C-NMR图谱，在92.73～119.02δ的低磁场领域，出现了多个异头碳信号峰，说明TPS3-1中的糖链比较复杂。在16.01～17.15δ的高磁场领域，同样出现了明显的信号峰，这个区域的信号归属于甲氧基中的碳信号，此结果进一步支持1H-NMR和化学分析结果。

图4 TPS3-1的1H-NMR和13C-NMR图谱Fig.4 1H-NMR and 13C-NMR spectra of TPS3-1

表2 TPS3-1的阶梯式部分酸水解中各酸浓度上清液中游离中性糖的含量Table 2 Contents of neutral carbohydrates in acidic supernatant of partial acidic hydrolysis of TPS3-1

多糖在酸性条件下可以被水解，但是不同结构的单糖残基对酸水解的敏感度有明显差异。中性糖苷键对酸的敏感度明显高于半乳糖醛酸等酸性糖，中性糖与糖醛酸结合的糖苷键又较酸性糖之间的糖苷键容易水解。对于中性糖，不同结构的单糖残基的糖苷键同样对酸水解的敏感度有明显差异，对酸水解最敏感的中性糖残基依次为呋喃型五碳糖、呋喃型六碳糖、吡喃型五碳糖、吡喃型六碳糖[18]。果胶毛发区域由阿拉伯糖(有呋喃型和吡喃型结构)、半乳糖、葡萄糖和鼠李糖等构成糖组成，因此可以通过阶梯式部分酸水解方法分析果胶毛发区域中的中性糖化学结构[19]。因此本研究采用阶梯式部分酸浓度水解方法对TPS3-1毛发区域的化学结构特征进行分析。表2列出了TPS3-1经过阶梯式部分酸浓度水解后，各酸浓度的水解上清液中中性糖占TPS3-1总中性糖质量的比。从表2可以看出，在0.01、0.05、0.5、2mol/L三氟乙酸的水解上清液中，各上清液中的中性糖含量分别为72.6%、4.8%、12.7%和9.6%，相当一部分的中性糖在第一个酸浓度溶液中水解游离出来。

对各酸浓度的水解上清液采用直接构成糖分析和先完全水解后进行构成糖分析等两种处理方式。直接构成半倍分析即上清液不经过酸完全水解阶段，直接按照Blakeney[7]法制备成糖的全乙酰化糖醇衍生物，此法只能分析上清液中的游离单糖，而不能分析寡糖或低分子多糖。相反，上清液先经过酸完全水解后进行乙酰化处理，则可以分析上清液中包括游离单糖、寡糖和低分子多糖。因此采用以上两种构成糖分析方法很容易获得降解糖的存在形式。

表3 TPS3-1的阶梯式部分酸水解中各酸浓度上清液的中性构成糖比Table 3 Neutral carbohydrate compositions in acidic supernatant of partial acidic hydrolysis of TPS3-1

从表3可以看出，在0.01mol/L三氟乙酸水解上清液的游离单糖中，未检出鼠李糖，阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖的物质的量比为39∶1∶1，表明绝大部分游离单糖为阿拉伯糖。水解上清液经过完全水解后，鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖的物质的量比为13∶39∶52∶39。这个结果表明水解上清液中除了游离单糖外，还有相当一部分的鼠李糖、葡萄糖和半乳糖以寡糖和低分子多糖的形式降解出来。从以上构成糖分析结果，可以推测此条件下降解出来的分子片段可能为图5A所示，主要由葡萄糖支链、阿拉伯糖支链和半乳糖醛酸支链组成。此分子片段中以鼠李-半乳糖醛酸为基本重复单位的主链比较长，但是离聚半乳糖醛酸平滑区域片段比较远，因此最容易被水解游离出来。这个分子片段在毛发区域中所占的比例约为73%左右。

在0.05mol/L三氟乙酸水解上清液的游离单糖中，未检出鼠李糖和葡萄糖，阿拉伯糖和半乳糖物质的量之比为40∶5，游离单糖中仍然以阿拉伯糖为主，只有约11%为半乳糖单糖。水解上清液经过完全水解后，鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖的物质的量比上升为8∶40∶8∶24。从以上构成糖分析结果，可以推测此条件下降解出来的分子片段为图5B所示，主要由葡萄糖或半乳糖与阿拉伯糖交替连接的寡糖支链组成。此分子片段中以鼠李-半乳糖醛酸为基本重复单位的主链比较靠近聚半乳糖醛酸片段，因此相对比较稳定。这个分子片段在毛发区域中所占的比例约为5%左右。

对于0.5mol/L三氟乙酸水解上清液，由于大部分糖已在前两个水解阶段降解，导致此阶段的糖样品量不足。因此此阶段对上清液全部进行完全水解后进行构成糖分析。从表中可以看出，水解上清液中未检出葡萄糖，鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖的物质的量比为1∶16∶12。从这个结果可以推测此条件下降解出来的分子片段为图5C所示，主要由半乳糖和阿拉伯糖交替连接的寡糖支链和分散在聚半乳糖醛酸上的阿拉伯糖残基组成。此分子片段中以鼠李-半乳糖醛酸为基本重复单位的主链与聚半乳糖醛酸片段相邻，因此对酸最稳定。这个分子片段在毛发区域中所占的比例约为13%左右。

图5 TPS3-1毛发区域分子片段的化学结构示意图Fig.5 Schematic diagram of molecular fragments from hairy region of TPS3-1

3 讨 论

以上研究结果表明，TPS3-1分子质量为4.15×106u，含有少量蛋白质，由富含阿拉伯糖和半乳糖以及少量葡萄糖为支链的毛发区域和被高度酯化的平滑区域组成的果胶糖蛋白。对于毛发区域，根据其中性糖残基对酸水解的敏感度将其分为3类分子片段，第一类分子片段主要由葡萄糖支链、阿拉伯糖支链和半乳糖醛酸支链组成。此分子片段中以鼠李-半乳糖醛酸为基本重复单位的主链离聚半乳糖醛酸片段最远，因此最容易被水解游离出来。这个分子片段在毛发区域中的质量百分比约占73%左右。第二类分子片段主要由葡萄糖或半乳糖与阿拉伯糖交替连接的寡糖支链组成。此分子片段中以鼠李-半乳糖醛酸为基本重复单位的主链比较靠近聚半乳糖醛酸片段，因此相对比较稳定。这个分子片段在毛发区域中的质量百分比约为5%左右。第三类分子片段主要由半乳糖和阿拉伯糖交替连接的寡糖支链和分散在聚半乳糖醛酸上的阿拉伯糖残基组成。此分子片段中以鼠李-半乳糖醛酸为基本重复单位的主链与聚半乳糖醛酸片段相邻，因此对酸最稳定。这个分子片段在毛发区域中的质量百分比约为13%左右。另外IR分析结果推测半乳糖主要以β-构型形式存在于分子中。

目前一些研究结果表明，果胶的化学结构与其生理活性有密切相关。比如分子质量为2.0×105u，含有β-聚半乳糖支链和聚阿拉伯糖支链的pH-修饰柠檬果胶，阿拉伯糖苷酶处理与否，对肿瘤标志物，半乳凝集素-3(galectin-3)的抑制效果有明显差异，酶处理后的抑制率达未处理的5倍以上[20]。从植物Vernonia kotschyana中提取得到的果胶对T细胞和B细胞的增殖没有明显的促进效果，因为果胶物质中的聚半乳糖醛酸没有功效作用，但是其中的阿拉伯半乳聚糖果胶物质有明显的细胞增殖促进效果[21]。Gunning等[22]比较了聚半乳糖、鼠李-半乳糖醛酸聚糖(RGⅠ)和聚半乳糖醛酸3种不同的果胶物质对galectin-3的识别效果。研究结果表明，只有聚半乳糖对galectin-3有识别效果，而两外两种果胶物质几乎没有任何效果，表明果胶物质中的半乳糖支链在识别galectin-3时起到重要的作用。TPS3-1的中性糖约为半乳糖醛酸的2倍，其中鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖的质量比为1∶4.2∶3.0∶0.4，毛发区域中含有阿拉伯糖支链、半乳糖支链以及少量的葡聚糖支链。如前所述，金花茶粗多糖具有明显的降血脂功能，而TPS3是金花茶的主要组成多糖，TPS3-1的化学结构是否与降血脂功能有密切相关有待进一步研究。

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