青藤碱-γ-环糊精包合物的性质及谱学分析

陈迪钊，朱士龙，李 勇，林红卫，段友构

(1.怀化学院化学化工系，湖南 怀化 418008；2.民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室，湖南 怀化 418008；3.吉首大学化学化工学院，湖南 吉首 416000)

青藤碱(sinomenine，SN)是从青风藤(Caulis sinomenii)中提取的一种有效成分，具有抗炎、免疫抑制、镇痛、抗心律失常等多种生物活性[1-4]。青藤碱在水溶液中溶解度较低，且对碱、光、热不稳定，易分解，故在医药、食品及保健品工业上常用其盐酸盐[5-6]。由于人体皮肤、口腔、胃黏膜等对酸、碱度较敏感，现有青藤碱的成品和制剂因其酸性过大，对人体产生较强的刺激作用，导致其在医药、保健品等使用中受到一定的限制。

环糊精(cyclodextrin，CD)是淀粉降解的环状低聚化合物，具有特殊的空腔结构[7]。CD可以和不同系列的客体分子发生包合作用，提高客体分子的溶解性和稳定性[8-9]。CD的这种独特的性质被广泛应用于食品、化妆品和制药工业中[10-12]。从目前CD的研究情况看，β-CD的应用最为常见[13-14]，但由于β-CD本身的水溶性小、组织刺激性大等缺点限制了其更广泛的应用，γ-CD的空腔直径和空腔体积要大于β-CD，且具有水溶性好、局部刺激小且毒性最小等优点[15]。青藤碱与γ-CD的包合作用研究未见报道，本实验选取γ-CD对青藤碱分子进行包合，成功制备γ-CD与青藤碱的包合物，并通过X射线粉末衍射(XRD)、红外光谱(IR)、差示扫描量热分析(DSC)、核磁共振(HNMR)等技术对包合物进行表征及基本性质研究，对青藤碱作为药品和保健品现有制剂的研究和改进具有重要的理论意义和潜在的应用价值，为环糊精在食品、保健品、化妆品等方面的开发和进一步研究应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

盐酸青藤碱(含量99.12%，批号100802) 陕西森弗生物技术有限公司；γ-环糊精(含量98.50%，批号100701)上海源叶生物科技有限公司；甲醇为色谱纯；其他化学试剂均为分析纯；用水为二次蒸馏水。

1.2 仪器与设备

Bruker D8 X射线粉末衍射仪 德国布鲁克公司；UV-2450紫外分光光度计、HPLC-10AT高效液相色谱仪(SPD-10AVP紫外检测器)、DSC-60差示扫描量热分析仪 日本岛津公司；Nikon SMZ-1000体式研究显微镜 日本尼康株式会社；MAGNA-IR750型FTIR红外光谱仪 美国Nicolet公司；INOVA-400核磁共振仪 美国Varian 公司。

1.3 方法

1.3.1 游离青藤碱的制备与纯化

由于实验所需药品为青藤碱，需对所购盐酸青藤碱进行游离青藤碱的制备。按文献[16]精确称取盐酸青藤碱，溶于一定量的二次蒸馏水中，搅拌使之充分溶解后逐滴加入氨水，产生乳白色胶状沉淀，继续加氨水至不再有新的沉淀产生为止。然后用氯仿萃取，将氯仿层用新蒸蒸馏水反复萃洗至中性。氯仿层用无水硫酸钠干燥过夜，用旋转蒸发仪减压蒸干得白色青藤碱粉末，放入干燥器中备用。

1.3.2 测定波长选择

取青藤碱、γ-CD，加蒸馏水溶解，以蒸馏水作为对照，分别在紫外分光光度计200～500nm波长处进行扫描，γ-CD在此范围内无吸收，青藤碱在265nm波长处有较大吸收，所以选择波长265nm为青藤碱测定波长。

1.3.3γ-CD对青藤碱的增溶作用研究

分别配制浓度为0、1.0、1.5、2.0、3.0mmol/L的γ-CD溶液，将纯化后的青藤碱加入使之达到饱和，溶液经0.45μm微孔滤膜过滤，稀释相同倍数后利用紫外吸收光谱在265nm波长处测定其吸光度。通过测定青藤碱的含量考察γ-CD浓度对青藤碱溶解度的影响。

1.3.4 青藤碱-γ-CD包合物的制备

环糊精与客体分子形成包合物的制备方法有共沉淀法、逐步滴加法、固体混合法等多种[17-19]，通过溶液法制备环糊精与客体分子包合物是实验室和工业生产中最常用的制备路线。因此本实验利用溶液共混法制备青藤碱-γ-CD包合物，制备工艺如下[20]：25℃条件下，按青藤碱与γ-CD物质的量比1∶1取样，在不断搅拌的条件下将青藤碱缓缓加入到γ-CD的饱和水溶液中，50℃条件下搅拌3h以确保包合反应进行完全。冷却至室温后置于冰箱中4℃条件下放置48h，由于γ-CD在水中溶解度较大，置于冰箱中4℃左右放置48h后未见晶体析出；置于旋转蒸发器下，50℃旋蒸出部分水，溶液出现浑浊，抽滤得少量包合物固体，小心将包合物用少量石油醚洗涤，室温干燥，置于干燥器中，备用。

1.3.5 青藤碱-γ-CD包合物的吉布斯自由能变化

分别配制浓度为0、1.0、1.5、2.0、3.0mmol/L的γ-CD溶液，加青藤碱使之达到饱和，溶液经0.45μm微孔滤膜过滤，稀释相同倍数后利用紫外吸收光谱在265nm波长处测定其吸光度，绘制青藤碱在γ-CD溶液中的溶解度曲线，并计算包合反应前后的吉布斯自由能变化。

1.3.6 青藤碱-γ-CD包合物的性质研究

将制备的青藤碱-γ-CD包合物分别通过显微晶体、X射线粉末衍射、差示扫描量热分析、红外光谱及核磁共振等方式进行表征和性质分析。

2 结果与分析

2.1 γ-CD对青藤碱的增溶作用研究

图1 γ-CD 对青藤碱增溶作用的光谱图Fig.1 UV spectrum of SN-γ-CD inclusion complex

由图1可知，随着γ-CD浓度的增加，青藤碱的溶解度逐渐增大，γ-CD对青藤碱有明显的增溶作用。

2.2 青藤碱-γ-CD包合物的相溶解度及吉布斯自由能变化研究

青藤碱的溶解度随环糊精的加入呈线性增加，根据Benesi-Hildebrand公式，该体系相溶解度曲线方程为典型的AL型，确定青藤碱与γ-CD的包合计量比为1∶1，则相溶解度方程为式(1)。

式中：c(CD)为环糊精物质的量的总浓度/(mol/L)；c0为CD存在下客体青藤碱分子的总浓度/(mol/L)；S0为客体青藤碱分子的固有溶解度(曲线的截距)；K为包合物的形成常数/(L/mol)。

以客体浓度对CD浓度作图，如图2所示，由图中的斜率和截距可获得包合物的形成常数K，根据包合常数K计算包合前后的吉布斯自由能变化，见式(2)、(3)[21]。

图2 青藤碱在25℃γ-CD溶液中的相溶解度图Fig.2 Effect of γ-cyclodextrin on the solubility of sinomenine in water at 25 ℃

经计算得：青藤碱与γ-CD的包合常数为600.3L/mol，该反应的吉布斯自由能为ΔG=－15.85kJ/mol。

2.3 青藤碱-γ-CD包合物的性质

2.3.1 青藤碱与γ-CD包合物的显微晶体分析

图3 青藤碱、γ-CD及包合物的显微晶体图片Fig.3 Crystal properties of SN-γ-CD inclusion complex

将制备的青藤碱、γ-CD及包合物经纯化后置于Nikon SMZ-1000体式研究显微镜下观察，如图3所示。青藤碱、γ-CD、青藤碱-γ-CD包合物存在较大区别；其中盐酸青藤碱是针状结晶，青藤碱是棱柱状结晶，γ-CD没有固定形态应为无定形结晶，青藤碱-γ-CD包合物的晶体形态不同于青藤碱也不同于γ-CD；青藤碱、γ-CD及青藤碱-γ-CD包合物颗粒的直径大小不相同。由晶体特征可以初步推测：青藤碱与γ-CD形成的包合物应是新的晶体形态。

2.3.2 青藤碱与γ-CD包合物的X射线衍射分析

对青藤碱、γ-CD及包合物进行XRD分析，分析条件：室温，Cu靶(Kα射线，波长=1.54187Å)扫描电压40kV，管电流40mA，扫描速率2°/min，采样间隔为0.02°，扫描范围5°～80°。30°以后图谱无明显变化，取5°～30°所得XRD图谱如图4所示。γ-CD的XRD峰形呈现出弥散形态，但其图谱上明显出现隆起并有少许强度较低的特征衍射峰出现，说明γ-CD的晶形介于微晶与晶体形态之间；在青藤碱-γ-CD的包合物图谱上可以看出，青藤碱-γ-CD包合物的晶形与γ-CD类似，没有良好的结晶形态；青藤碱-γ-CD包合物中出现一组明显新的特征衍射峰(2θ= 7.42°、2θ= 14.52°、2θ= 20.34°)，此外青藤碱、γ-CD的特征衍射峰在其包合物中几乎完全消失；青藤碱-γ-CD包合物表现出明显不同于前两者的新的特征性质，说明青藤碱-γ-CD包合物是一种新的物质形态。

图4 青藤碱(a)、青藤碱-γ-CD包合物(b)与γ-CD (c) XRD比较Fig.4 X-ray diffraction of sinomenine (a), SN-γ-CD inclusion complex(b) and γ-CD (c)

2.3.3 青藤碱-γ-CD包合物的差示扫描量热分析

图5 青藤碱(a)、γ-CD(b)、青藤碱与γ-CD物理混合物(c)、青藤碱-γ-CD包合物(d)DSC图Fig.5 DSC diagrams of sinomenine (a), γ-cyclodextrin (b), physical mixture (c) and inclusion complex (d)

测试条件：坩埚：铝坩埚；参比物：Al2O3；气氛：N2；升温速率为10℃/min；升温范围为30～350℃，结果见图5。青藤碱在160.6℃及182℃出现2个尖锐的特征吸热峰；298℃的吸热峰表明γ-CD的熔点在298℃左右，83℃出现的吸热峰说明γ-CD含有少量水存在。在两者的物理混合物的DSC图谱中，青藤碱的吸热峰强度显著降低，但峰的位置没有发生明显变化；而在两者的包合物的DSC图谱中，青藤碱的吸收峰完全消失，且γ-CD的吸热峰也没有出现，较青藤碱和γ-CD的图谱有明显的差异。

2.3.4 青藤碱-γ-CD包合物的红外光谱分析

采用KBr压片法测定青藤碱、γ-CD、物理混合物和包合物的红外光谱，分辨率为2cm-1，4000～400cm-1全谱扫描，所得红外图谱见图6。3600cm-1左右出现的是青藤碱酚羟基的吸收峰，在3000cm-1以下有芳环骨架上的C—H伸缩振动，1688cm-1左右出现了较强的羰基吸收峰，1635、1510cm-1处出现芳环骨架振动，N—CH3及O—CH3表现为1450cm-1左右的弯曲振动。γ-CD主要红外特征吸收峰有：3384cm-1为γ-CD上多缔合体—OH的伸缩振动；2924cm-1甲基、亚甲基C—H的伸缩振动；1647cm-1，结合水振动；1417、1259cm-1—OH的平面弯曲振动；1367、1336、1303cm-1C—H弯曲振动；1156cm-1C—O—C的反对称伸缩振动；1080、1030cm-1，C—C、C—O或C—C—O的伸缩振动。青藤碱与γ-CD的物理混合红外光谱图中，青藤碱的吸收峰均明显存在，只是叠加了γ-CD的吸收峰。青藤碱与γ-CD包合物的红外谱图中，青藤碱的一些特征吸收峰强度明显降低，峰形变宽，其中芳环骨架振动吸收峰产生了较大的位移(1587～1509cm-1)或者消失(1122cm-1)，单键伸缩振动及弯曲振动的指纹区(1300～1000cm-1)的许多吸收峰也出现消失或较大位移，如1284、1198、1145、1056cm-1等。

图6 青藤碱(a)、γ-CD(b)、青藤碱与γ-CD物理混合物(c)及青藤碱-γ-CD包合物(d)红外光谱图Fig.6 IR spectra of sinomenine (a), γ-cyclodextrin (b), physical mixture(c) and inclusion complex (d)

以上红外特征光谱的变化充分说明：γ-CD与青藤碱主客体分子间发生了相互作用，青藤碱分子进入γ-CD的空腔中，包合物已经形成。

2.3.5 青藤碱-γ-CD包合物的核磁共振分析

表1 包合物形成前后γ-CD的氢核化学位移变化Table 1 Change in 1H chemical shift of γ-CD before and after inclusion with sinomenine

对青藤碱、γ-CD及其包合物进行1HNMR分析，分析条件：DMSO-d6、400MHz、25℃，通过不同图谱的分析比较，氢质子位移变化如表1所示。客体青藤碱分子和主体γ-CD分子包合后，γ-CD的质子发生明显的化学位移，青藤碱的质子H在包合物的图谱上峰高和峰面积发生很大变化。γ-CD的质子H3和H5及2—OH、3—OH、6—OH发生明显偏移，而H2和H4的变化很小，造成这一现象的主要原因与青藤碱及γ-CD的结构密切相关。分析其可能原因是包合物形成后，青藤碱分子进入γ-CD空腔内部，由于客体分子芳香基团环电流的影响位于γ-CD空腔内壁的两个质子H3和H5发生移动，化学位移值发生变化。青藤碱分子上的基团与环糊精分子的2—OH、3—OH、6—OH形成分子间氢键，电子屏蔽作用减小[22]，吸收峰将移向低场，化学位移值增大。通过青藤碱氢质子峰面积的减小及氢质子的位移变化充分说明青藤碱分子与γ-CD之间发生了作用，青藤碱分子已经进入到γ-CD空腔中。

3 结 论

通过溶液共混法成功制备了青藤碱与γ-CD的包合物，并通过晶体形态的显微图像、差示扫描量热分析、红外光谱、X射线粉末衍射及核磁共振等方式对包合物进行了基本性质的研究和分析，实验结果证明γ-CD对青藤碱具有明显的增溶作用，青藤碱-γ-环糊精包合物表现出明显不同于青藤碱的特征波谱性质。利用相溶解度法计算出青藤碱与γ-CD形成的包合物的包合物质的量比均为1∶1，其包合常数为600.3L/mol，该反应的吉布斯自由能变化为ΔG=－15.85kJ/mol。实验结论为青藤碱作为药品和保健品的开发和现有制剂方式的改进提供重要的参考，为环糊精在食品、保健品及化妆品等工业的进一步研究应用提供一定的理论依据。

[1]LIANG Liu, EBERHARD B, DENNIS B, et al.Amelioration of rat experimental arthritis by treatment with the sinomenine[J].Int J Immunopharmac, 1996, 18(10)∶ 529-534.

[2]游素芬, 戈萌.青藤碱的医药新用途∶ 中国, CN1679574A[P].2005-10-12.

[3]傅绍萱.青藤碱的药理作用Ⅱ—Ⅶ[J].药学学报, 1963, 10(11)∶ 673-675.

[4]叶仙蓉, 颜克序, 吴克美, 等.青藤碱衍生物的合成及其抗炎镇痛活性[J].药学学报, 2004, 39(3)∶ 180-183.

[5]GOTO K, SUDZUKI H.Studies on bimolecular alkaloids partⅠ—Ⅱ[J].Bull Chem Soc Jpn, 1929, 4∶ 107-111.

[6]ISHIWARI N.An alkaloid of sinomeium diversifolium[J].Journal of Chemical Society Abstracts, 1921, 120∶ 1354.

[7]童林荟.环糊精化学-基础与应用[M].北京∶ 科学出版社, 2001∶ 11-25.

[8]DAVIS M E, BREWSTER M E.Cyclodextrin-based pharmaceutics∶ past,present and future[J].Nature Reviews Drug Discovery, 2004, 3(12)∶ 1023-1035.

[9]SONG Li, PURDY W C.Cyclodextrins and their applications in analytical chemistry[J].Chem Rev, 1992, 92(6)∶ 1457-1470.

[10]MONTASSIER P, DUCHENE D, POELMAN M C.Inclusion complexes of tretinoin with cyclodextrins[J].International Journal of Pharmaceutics, 1997, 153(2)∶ 199-209.

[11]王晓云, 姜子涛, 李荣.环糊精及其衍生物与天然抗氧化剂杨梅素的包合作用研究[J].食品科学, 2008, 29(5)∶ 125-128.

[12]SZEJTLI J, SZENTE L.Elimination of bitter, disgusting tastes of drugs and foods by cyclodextrins[J].European Journal of Pharmaceutics and Biopharm Aceutics, 2005, 61(3)∶ 115-125.

[13]程霜, 杜凌云, 牛梅菊, 等.β-环糊精和染料木黄酮包合作用的研究[J].食品科学, 2006, 27(2)∶ 94-99.

[14]STRICKLEY R G.Solubilizing excipients in oral and injectable formulations[J].Pharmaceutical Research, 2004, 21(2)∶ 201-230.

[15]GUO X, SHUANG S, WANG X, et al.Comparative study on the inclusion behaviour of cyclodextrin derivatives with venoruton and rutin by thin layer chromatography[J].Biomedical Chromatography, 2004, 18(8)∶ 559-563.

[16]罗烈.青藤碱衍生物的合成及镇痛抗炎作用的定量构效关系研究[D].武汉∶ 武汉大学, 2005.

[17]国家药典委员会ISBN978-7-5067-4439-3, 2010.1中国药典二部[S].北京∶ 中国医药科技出版社, 2010.

[18]FERNANDES C M, VEIGA fJ B.The cyclodextrins in pharmacol technology.Ⅲ.Preparation and characterization of inclusion complexes in solid state[J].Revista de Ciencias Farmaceuticas, 1999,20(2)∶ 375-387.

[19]续浩, 陈亮.环糊精包结物的制备与研究方法[J].分析测试技术与仪器, 2001, 7(3)∶ 143-151.

[20]朱士龙, 李勇, 林红卫, 等.青藤碱-环糊精包合工艺的优化及包合常数测定[J].食品科学, 2012, 33(8)∶ 54-59.

[21]傅献彩, 沈文霞.物理化学[M].5版.北京∶ 高等教育出版社, 2006∶ 165-166.

[22]姚新生.有机化合物波谱分析[M].北京∶ 中国医药科技出版社,2004∶ 126-127.