乳酸杆菌代谢产物对阴道常见致病菌抑制作用的试验研究

魏利杰，徐琳，王锦卓(.吉林省人民医院妇产科，吉林长春300;.吉林省长春市妇产医院麻醉科，吉林长春300)

正常妇女，在雌激素的影响下阴道上皮细胞增生，表层细胞角化，阴道酸碱度保持在4～5，使适应碱性的病原菌的繁殖受抑制，颈管黏液呈碱性，使适应酸性病原菌的繁殖受抑制，当此自然防御功能受破坏时，易导致阴道炎。寄生于阴道内的细菌包括革兰阳性需氧菌及厌氧菌，各种细菌通过黏附机制生长于阴道黏膜，阴道菌之间相互拮抗、相互依赖，并受机体内分泌的调节和阴道内环境的影响而维持着动态平衡，在正常菌群中，以乳酸杆菌占优势，阴道上皮的糖原经乳酸杆菌作用分解成乳酸，使阴道局部呈弱酸环境，抑制其他细菌过度生长，从而维持阴道正常菌群。然而由于个体激素水平的巨大差异、生活方式、药物使用等方面的不同，易导致细菌的抗药性和机体的菌群失调，进而使得阴道炎性反应迁延反复[1]。目前对于各种原因所致阴道炎的治疗方法仍以抗菌药物为主，未注重对阴道内环境的恢复和调整，且易造成病情反复。故此，对维持阴道的酸碱平衡，日益引起重视。目前资料表明，非特异性细菌性阴道炎发生可能与阴道乳酸杆菌数量的减少或缺失相关[2]。本文通过试验研究观察了乳酸杆菌代谢产物对女性阴道常见致病菌抑菌作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株来源:乳酸杆菌、肠球菌、铜绿假单胞菌、伤寒杆菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌均由吉林大学白求恩医学院微生物教研室惠赠。

1.1.2 主要试剂:IMDM(美国GIBCO)，营养肉汤培养基(杭州天和微生物制剂有限公司)、小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所生产)，营养琼脂培养基。

1.2 试验方法

乳酸杆菌代谢产物的制备将对数生长期的乳酸杆菌接种于LC液体培养基，37℃培养24 h，当浓度达到1×1010个/ml时滤器除菌，用无菌瓶分装滤液分装，置4℃冰箱备用。

营养琼脂平板培养基的制备取灭菌后的营养琼脂培养基倾注于直径10 cm的无菌平皿内，控制培养基的厚度0.5～0.6 cm，冷却后置4℃冰箱备用。

细菌液的制备取对数生长期的大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、伤寒杆菌和肠球菌分别接种于10 ml的无菌肉汤培养基中，置37℃恒温培养箱中培养18 h后取出，配制成1×106个/ml菌液，置4℃冰箱备用。

阴道上皮细胞的制备取25位年龄20～50岁，妇科检查正常，月经周期10～14 d的妇科门诊就诊者的阴道上皮细胞。用刮板轻轻刮去阴道后壁上段细胞，悬浮于RPMI1640培养液中，反复吹打，离心5 min，重复3次。使细胞浓度为2×106个/ml，接种于24孔细胞培养板中，每孔1 ml置CO2孵育箱中培养6 h，用无菌生理盐水洗涤3次。

乳酸杆菌对各种常见致病菌抑菌环试验研究取制备好的培养板，将配置好的菌液0.5 ml滴加在培养板中央，用无菌L棒将细菌涂均，每种细菌做3块培养板，每块培养板均匀放置4个无菌的药敏杯，试验组:其中2个药敏杯中加入0.5 ml制备好的乳酸杆菌代谢产物;对照组:另2个药敏杯中加入0.5 ml无菌生理盐水。分别做记号标志，放置37℃恒温培养箱中培养24 h。

乳酸杆菌对各种常见致病菌阴道上皮细胞黏附抑制试验研究取上述制备好阴道上皮细胞的24孔培养板，第1～3行每孔分别加入乳酸杆菌代谢产物滤液0.5 ml，为试验组，第4～6行不加，为对照组。从第1行至第6行每孔分别加入0.2 ml制备好的大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、肠杆菌和白色念珠菌菌液，置CO2孵育箱培养2 h，用无菌生理盐水洗涤3次。

1.3 统计学方法:每次试验都重复3次，数值用均数±标准差(±s)来表示，比较分析用t检验。

2 结果

乳酸杆菌代谢产物对阴道常见致病菌的抑菌情况分析采用抑菌环试验，观察此产物对肠杆菌、大肠埃希菌、胞菌、铜绿假单伤寒杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌等常见致病菌的抑制生长情况，同时分别提取3块各种菌试验培养板的抑菌环大小的平均值作为试验结果，并与对照组相对比，结果见表1。

表1 乳酸杆菌代谢产物对常见致病菌的抑菌环直径分析(±s)

表1 乳酸杆菌代谢产物对常见致病菌的抑菌环直径分析(±s)

菌株strains抑菌环直径(cm)试验组1.7±0.20.0铜绿假单胞菌2.7±0.60.0金黄色葡萄球菌2.8±0.40.0伤寒杆菌1.5±0.10.0肠球菌0.00.0白色念珠菌生理盐水对照组大肠埃希菌0.00.0

乳酸杆菌代谢产物抑制各种常见致病菌与阴道上皮细胞黏附情况分析采用革兰染色法，镜下观察乳酸杆菌代谢产物对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、肠杆菌和白色念珠菌与阴道上皮细胞的黏附抑制情况。各孔随机计数100个细胞，以黏附10个以上细菌为黏附阳性，取各孔平均数为试验结果，结果见图1。

图1 乳酸杆菌代谢产物对常见致病菌与阴道上皮细胞黏附能力的抑制作用分析

3 讨论

健康女性阴道内存在许多寄生细菌，包括需氧菌和厌氧菌。主要的革兰阳性菌有:乳酸杆菌、棒状杆菌、肠球菌等;主要的革兰阴性菌有:大肠埃希菌、加德纳菌、动弯杆菌等其中许多成员具有潜在的致病作用[2]。本研究结果表明，乳酸杆菌代谢产物对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和伤寒杆菌有抑菌作用，其抑菌环直径分别为(1.7±0.2)cm、(2.7±0.6)cm、(2.8±0.4)cm和(1.5±0.1)cm，与对照组抑菌环直径为0相比具有明显差异(P﹤0.05)，这一结果为临床应用乳酸杆菌及其制剂提供试验基础。本试验还发现，乳酸杆菌代谢产物对肠球菌和白色念珠菌未见明显抑制效果，因此抑菌环试验尚不能阐述乳酸杆菌的抗病机理，推测乳酸杆菌对肠球菌和白色念珠菌的抑制作用可能与代谢产物直接杀菌无关，是否存在其他抑制的间接作用仍需其他试验进一步验证研究。

阴道的酸性环境是维持阴道的内环境平衡的重要条件，乳酸杆菌产生的乳酸可抑制类杆菌及其他需氧菌、兼性厌氧菌的生长[3]。本研究显示乳酸杆菌代谢产物抑制大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、伤寒杆菌、肠杆菌、白色念珠菌和金黄色葡萄球菌对阴道上皮细胞的黏附作用效果好，可以明显地降低它们与阴道上皮细胞黏附数量，试验组与阴道上皮细胞黏附数分别为29.4±4.9、36.7±5.3、29.1±4.1、22.5±3.2、24.7±2.9和43.1±3.9，明显低于对照组的黏附阴道上皮细胞数目的91.8±12.1、90.1±10.3、95.6±13.2、90.6±9.8、87.5±10.1和94.9±13.2，两组相比较具有显著性差异(P﹤0.05)。这一结果提示，乳酸杆菌对上述常见致病菌与阴道上皮细胞的黏附具有明显的抑制作用。根据这一结果推测，高浓度的乳酸杆菌代谢产物可能会竞争性地抑制阴道病原菌的黏附能力，或从某一环节阻断病原菌对阴道上皮细胞的黏附能力，故应用的乳酸杆菌及其代谢产物对阴道病原菌有抑制作用，但是否还有抑制其他因子的分泌、存在浓度抑制等需要进一步试验研究来验证。

综上所述，本研究证实乳酸杆菌及其代谢产物对白色念珠菌、铜绿假单胞菌、肠杆菌、伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌等感染所致的女性阴道炎性反应有较好的治疗作用和预防功能，与目前以乳酸杆菌为主导的较健康的阴道微生态有利于提高阴道对各种病原微生物抗感染能力的相关报道一致，并且乳酸杆菌的代谢产物没有不良反应，为阴道炎的治疗研究提供了一种新的有效方法。

[1] 康白，吕虎，傅晓丽.对DM8909菌株治疗菌群是条性阴道病作用机制的研究[J].中国微生态学杂志，2001，13(4):192.

[2] Redondo LV，Cook RL，Sobel JD.Emerging role of lactobacilli in the control and maintenance of the vaginal bacterial nicoflora[J].Rev lnfet Dis，1990，37(12):856.

[3] Donati L，Di Vico A，Nucci M.Vaginal microbial flora and outcome of pregnancy[J].Arch Gynecol Obstet，2010，281(4):589.