三氧化二砷联合5-氟尿嘧啶对小鼠肝癌H22细胞株的抑制作用

金洲祥，王向昱

（温州医科大学附属第二医院 肝胆外科，浙江 温州 325027）

合理的联合用药是肿瘤化疗的基本原则，其目的是为了获取药物间的协同效应。将各种化疗药物进行有机结合和多靶点治疗以提高疗效、降低毒性和克服耐药成为当前肿瘤治疗领域的一个新的研究热点。目前对于晚期肝癌的药物干预治疗方案还是以5-氟尿嘧啶（5-FU）为主的综合化疗方案。5-FU本身不良反应较大，长时间使用也存在耐药性的问题，极大地限制了其在临床上的大剂量应用。因此寻求一种更有效的抗癌药物或更有效的联合用药方案是提高肝癌临床总体疗效的关键。

有文献报道三氧化二砷（arsenic trioxide，As2O3）在体外对肝癌细胞株有抑制增殖、诱导凋亡的作用，其机制是使肝癌细胞阻滞于S期，从而抑制细胞增殖[1-2]，而5-FU是细胞周期特异性药物，其抗肝癌作用主要是作用于S期细胞，因此，联合用药可能具有协同效应。但是目前关于As2O3联合5-FU应用在肝癌治疗中的相互作用关系鲜见报道，因此我们设计本实验以研究体外As2O3联合5-FU对小鼠肝癌细胞株H22增殖、凋亡的影响，为临床上两者联合应用治疗肝癌提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料 小鼠肝癌H22细胞株购自南京凯基生物科技发展有限公司；0.1% As2O3溶液（亚砷酸）购于哈尔滨伊达药业公司；5-FU注射液为天津金耀氨基酸有限公司产品；TUNEL试剂盒、RPMI 1640液体培养基购自南京凯基生物科技发展有限公司；四甲基偶氮唑盐（MTT）试剂盒和二甲基亚砜（DMSO）均为南京凯基生物科技发展有限公司产品；10%胎牛血清、1% L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.25%胰酶消化液、EDTA消化液、3% H2O2、PBS均为杭州昊天生物技术有限公司产品。

1.2 MTT法检测药物对小鼠肝癌H22细胞生长的抑制作用

1.2.1 细胞培养：小鼠肝癌H22细胞株接种于培养瓶中，在5% CO2、37 ℃及饱和湿度培养箱中培养，用含10%胎牛血清、1% L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养液传代培养，24 h更换培养液1次，取传代后处于对数生长期细胞用于实验。细胞传代方法按照文献[3]介绍的方法。1.2.2 MTT法检测药物对小鼠肝癌H22细胞增殖率的影响：取对数生长期的H22细胞制成每毫升含5×104个细胞的悬浊液，加入96孔培养板（每孔细胞数为1×104个）中培养24 h后，参考有关文献[4-5]来确定各实验组的药物浓度，分为对照组（不加药物）、As2O3（终浓度分别为0.5、1.0和2.0μg/mL）组、5-FU（20 mg/L）组、As2O3（终浓度分别为0.5、1.0和2.0μg/mL）+5-FU（20 mg/L）组，按两因素析因设计分为8组，每组设3复孔。放入37 ℃、5%CO2培养箱内培养24、48及72 h后，每孔加MTT溶液（5 mg/mL）10μL，37 ℃继续孵育4 h后，吸去孔内培养液，每孔加100μL的DMSO，振荡10 min，使着色剂充分溶解后用Quant型酶标仪（Bio-Tek公司）在单波长570 nm下测出各孔吸光度（OD）值。按下列公式计算细胞增殖抑制率：增殖抑制率（%）=（1-处理组平均OD值/对照组OD值）×100%。以上实验重复3次。并计算药物相互作用系数（CDI）：CDI＝AB/（A×B）（其中AB为两药联合组与对照组OD值的比值，A或B是各单药组与对照组OD值的比值）。如CDI＜1，则两药作用性质为协同；如CDI=1，则两药作用性质为相加；如CDI＞1，则两药作用性质为拮抗[6-7]。

1.3 TUNEL荧光染色法检测药物对小鼠肝癌H22细胞凋亡率的影响 取对数生长期H22细胞接种于96孔板中，每孔细胞数为1×106个。培养24 h后弃去上清液，分组方法同1.2.2。37 ℃培养箱内放置24、48、72 h后，0.25%胰蛋白酶消化收集各组细胞。参照TUNEL试剂盒说明书操作，检测细胞凋亡率。结果判断标准：用荧光显微镜观察，凋亡细胞的细胞核着绿色，并呈固缩状或碎片状。每片观察5个高倍视野，细胞凋亡率用100个细胞中凋亡细胞个数百分比来表示。以上各浓度组均为3个复孔，最后结果为3个复孔的均值。上述实验重复3次。

1.4 统计学处理方法 用SPSS 10.0软件分析结果。实验数据均用±s表示，单处理因素各组间样本均数的多重比较采用单因素方差分析和LSD-t检验，两组比较采用成组t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测药物对H22细胞增殖的影响 结果显示：在0.5～2.0μg/mL浓度范围内As2O3对小鼠肝癌H22细胞增殖呈明显的抑制作用，且有时间-浓度依赖性，随药物浓度增加和作用时间的延长其抑制作用也增加；不同浓度的As2O3与5-FU联合应用后对小鼠肝癌H22细胞增殖的抑制作用均较各相应单药组明显增加（P＜0.01）。两因素析因设计分析提示，As2O3联合5-FU处理小鼠肝癌H22细胞24、48和72 h时两药交互作用有意义（P＜0.01）。具体见表1、图1-2。

两药联合作用时，计算两药CDI值来判断合用效果。结果表明：As2O3与5-FU联合作用H22细胞24和48 h时，两药具有协同作用（CDI＜1），作用72 h时，两者之间为相加作用（CDI=1）。

表1 各组H22细胞的增殖抑制率（±s，%）

表1 各组H22细胞的增殖抑制率（±s，%）

作用时间（h） 5-FU（mg/L） As2O3（μg/mL）0 0.5 1.0 2.0 24 0 0 4.72±0.46 27.61±0.58 30.00±0.13 20 18.50±0.60 34.82±0.14 40.25±1.37 47.78±0.24 48 0 0 22.50±0.41 30.56±0.44 39.13±0.72 20 26.51±0.52 40.31±0.35 47.75±0.54 53.23±0.70 72 0 0 34.31±0.40 43.91±0.34 53.41±0.61 20 37.40±0.950 51.75±0.64 55.98±0.10 61.07±0.21

图1 不同浓度As2O3对小鼠肝癌H22细胞株增殖的影响

图2 不同浓度As2O3联合5-FU对小鼠肝癌H22细胞株增殖的影响

2.2 TUNEL荧光染色法检测药物对H22细胞株凋亡的影响 单用As2O3或5-FU处理H22细胞，或经不同浓度As2O3联合5-FU作用24、48、72 h后，在荧光显微镜下均可观察到H22细胞出现细胞凋亡的典型形态学改变，主要表现为凋亡细胞核染色质着绿色并呈固缩状或碎片状。半定量计数结果表明，不同浓度As2O3联合5-FU对H22细胞的凋亡诱导率均较各相应的单药组明显增强，其诱导凋亡作用与药物亦呈明显的量效与时效关系。两因素析因设计分析显示，As2O3和5-FU处理H22细胞24、48和72 h，两药诱导细胞凋亡均有交互作用，P＜0.01（见表2、图3-4）。

3 讨论

目前研究认为，肿瘤的发生和发展不仅是肿瘤细胞增殖和分化异常所致，而且还是肿瘤细胞凋亡异常的结果[8]。因此，抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞分化和凋亡，对临床治疗肿瘤有指导意义。临床上化疗是治疗癌症的一种重要的手段，通常为增强疗效，都是联合使用几种药物。合用具有不同作用的几种药物，可以杀死更多的癌细胞并可降低人体对某种特定药物产生耐药性的可能，同时以几种方式攻击癌细胞，比单用一种药物更有疗效。

5-FU属细胞周期特异性药物，主要作用于S期细胞，其作用机制是在体内转变为氟脲嘧啶脱氧核苷酸（FdUMP），在辅因子5，10-亚甲基四氢叶酸（CH2FH4）的参与下，代替正常的脱氧核苷酸（dUMP)，与胸苷酸合成酶（TS）形成三联复合物，使TS失活，从而阻断dUMP甲基化转变为脱氧胸苷酸（dTMP)过程，影响细胞DNA的合成（S期），最终导致细胞死亡[9]。As2O3俗称砒霜，是一种传统中药，19世纪，西方国家曾有人用砷剂（如含As2O3的Fowlers液)口服治疗白血病。20世纪70年代我国学者首先发现其治疗急性早幼粒细胞白血病（APL）效果显著，并取得了较好的临床疗效，其作用机制是诱导APL细胞凋亡而抑制肿瘤生长[10]。近年来有报道称，As2O3在体外对人的肝癌细胞株有抑制增殖、诱导凋亡、调控细胞周期等作用[1-2，11-12]。有研究证实As2O3较某些化疗药物具有更强的诱导肝癌细胞凋亡的效应[13]。砷剂引起细胞凋亡的可能机制是：砷可直接与蛋白质的巯基结合，影响巯基酶的活性，使蛋白质灭活，引起细胞代谢异常，发生细胞凋亡[14]；还能下调抑凋亡基因bcl-2，增加促凋亡基因bax的表达以及改变两者之间的比例，促使Fas基因的表达增强，促进其凋亡[15]。刘琳等[1]研究发现，As2O3选择性诱导人肝癌细胞QGY-7701和QGY-7703凋亡，细胞周期延长，细胞集中在S期。

表2 各组H22细胞的凋亡率（±s，%）

表2 各组H22细胞的凋亡率（±s，%）

作用时间（h） 5-FU（mg/L） As2O3（μg/mL）0 0.5 1.0 2.0 24 0 1.95±0.17 14.20±0.38 25.38±0.37 31.11±0.40 20 35.04±0.79 44.92±0.60 53.25±0.60 61.22±0.42 48 0 2.01±0.12 20.25±0.33 40.10±0.38 59.36±0.32 20 60.00±0.44 66.93±0.51 74.72±0.53 85.34±0.44 72 0 2.31±0.19 22.07±0.10 42.16±0.64 62.66±0.28 20 64.42±1.05 69.66±0.40 78.02±0.13 87.67±0.93

图3 各组H22细胞凋亡情况（TUNEL，×200）

图4 不同浓度As2O3单独或联合20 mg/L 5-FU作用48 h后细胞凋亡率

目前关于联合As2O3与其他抗肿瘤药物体外杀伤肝癌细胞的协同作用的机制国内外尚鲜见文献报道。根据抗癌药物的敏感标准，药物的敏感性与其抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡发生率有关，抑制肿瘤细胞增殖的能力或诱导癌细胞凋亡的阈值与化疗效果有着某种内在联系[16]。因此本实验研究观察了体外As2O3与5-FU单用和联合处理小鼠肝癌H22细胞后，测定抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡的能力，探讨体外联合用药的特性，为进一步的体内实验提供可行性依据。

本实验采用MTT法观察As2O3联合5-FU对小鼠肝癌H22细胞增殖的影响。结果证明，在0.5～2.0μg/mL浓度范围内As2O3对小鼠肝癌H22细胞呈明显的抑制增殖作用，与近年来的相关报道[17]相一致。不同浓度的As2O3与5-FU联合作用，对小鼠肝癌H22细胞的抑制增殖作用均较相同时间内单用其中任何一种药物时明显增强，且随着作用时间的延长和药物浓度增加，作用效果也显著增加。两因素析因设计分析显示，As2O3联合5-FU处理小鼠肝癌H22细胞24、48和72 h，两药均有交互作用（P＜0.01）。根据药物受体动力学规律，若两药在任何剂量条件下合用均超过其中强药的最大反应，则两药可能作用于不同受体。结合本实验中As2O3与5-FU同时合用后对小鼠肝癌H22细胞的增殖抑制率明显高于单独使用，提示此两药在体外可能通过作用于不同的受体对肿瘤细胞产生杀伤作用。

CDI评价显示，联合用药24和48 h时，作用性质为协同；联合用药72 h时，作用性质为相加。以上分析提示，在一定时间内As2O3与5-FU合用后对小鼠肝癌H22细胞的增殖抑制作用明显提高，两者具有协同作用，药物在不同时间相互作用的性质不同，其机制有待进一步深入研究。

本实验研究发现，体外As2O3在0.5～2.0μg/mL 浓度范围内对小鼠肝癌H22细胞呈明显的诱导凋亡作用。不同浓度的As2O3与5-FU联合作用后，诱导小鼠肝癌H22细胞凋亡作用均较单用其中一药物时增强，且随着作用时间的延长和药物浓度增加，作用效果也显著增加。两因素析因设计分析显示，As2O3联合5-FU处理H22细胞24、48和72 h，两药均有交互作用（P＜0.01）。这说明As2O3能诱导小鼠肝癌H22细胞凋亡。联合5-FU后能显著提高细胞凋亡率，为我们下一步对体内移植瘤影响的研究提供了理论和实验依据。

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