磺胺类药物电喷雾质谱高能裂解规律

王敏，张海燕，，杨金良，刘鑫，严华，李建辉，张朝晖，崔凤云，何悦，叶晓霞

（1.温州医科大学 药学院，浙江 温州 325035；2.北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心 食品实验室，北京 100026）

磺胺类药物（sulfonamides，SAs）是目前广泛应用在畜禽抗感染治疗中的重要药物之一，在家禽养殖业方面，SAs可预防球虫病、霍乱和感染性鼻炎，但SAs有不良反应，可导致过敏反应和造血紊乱。国际食品法典委员会（CAC）和许多国家对食品和饲料中的SAs含量作了明确的规定[1-2]。

质谱是对未知化合物分子进行定性和解析的重要工具[3-6]。高能诱导裂解（higher energy collision induced dissociation，HCD）技术是一项新型的质谱裂解技术，与离子阱质谱常用的碰撞诱导解离（collision induced dissociation，CID）技术相比，HCD技术提供了稳定的高能裂解方式，并可改善CID裂解中产生的低质量碎片丢失（cutoff）效应，与Orbitrap质量分析器结合还可提供高分辨质谱数据[7-9]。HCD技术在蛋白质、肽段的鉴定和测序领域具有突出优势，在代谢物鉴定、食品添加物分析方面也有文献[7-17]报道。

有关SAs在三重四级杆和离子阱质谱中的裂解方式已有文献[18-26]报道，但其高能裂解机制尚鲜见报道。我们通过对SAs药物结构母核鉴定技术进行研究，掌握LTQ-Orbitrap XL多级高分辨质谱对药物特征基团的判定在兽药中的应用，对常见的15种SAs在高能裂解池中的裂解规律进行了研究，得到更为丰富的离子信息，并对比了HCD和CID两种裂解模式的差异。

1 材料和方法

1.1 仪器设备 LTQ-Orbitrap XL线性离子阱-轨道离子阱高分辨组合式质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），配置电喷雾离子源（ESI源）。

1.2 试剂和材料 15种SAs标准品均购自Dr.Ehrenstorfer公司，分别是磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine）、磺胺二甲嘧啶（sulfamethazine）、磺胺-6-甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine）、磺胺嘧啶（sulfadiazine）、磺胺甲氧哒嗪（sufamethoxy pyridazine）、磺胺二甲氧嘧啶（sulfadimethoxine）、磺胺氯哒嗪（silfachloropyridazine）、磺胺甲基异噁唑（sulfamethoxazole）、磺胺二甲噁唑（sulfamoxol）、磺胺苯吡唑（sulfaphenzole）、磺胺甲噻二唑（sulfamethizol）、磺胺吡啶（sulfapyridine）、磺胺醋酰（sulfacetamide）、磺胺噻唑（sulfathiazloe）、磺胺胍（sulfaguanidne monohydrate），纯度均在98%以上。结构见图1。其他试剂均为色谱纯，标准品用50%甲醇水溶液配置成100 ng/mL的混合溶液。实验用水为Milli-Q超纯水。

图1 15种SAs的分子结构式

1.3 质谱条件 ESI正离子模式下蠕动泵直接进样，流速10μL/min。喷雾电压4.5 kV，毛细管温度350℃，壳气流速30 arb，HCD裂解碰撞气为高纯氮气，HCD归一化碰撞能量55.0%。CID裂解碰撞气为高纯氦气，CID归一化碰撞能量55.0%。

2 结果和讨论

2.1 磺胺类化合物的HCD裂解 15种SAs化合物在ESI正离子模式下的一级质谱均产生准分子离子峰[M+H]+，说明SAs化合物易与H+结合形成[M+H]+。通过相应的HCD二级质谱扫描，得到了各化合物的碎片离子峰信息。比较15种SAs的HCD二级质谱图，发现均存在特征离子[C6H6NSO2]+m/z 156.01138、[C6H6NO]+m/z 108.04439、[C6H6N]+m/z 92.04948和[C5H5]+m/z 65.03858（如图2所示）。相关文献[24]曾报道SAs的准分子离子[M+H]+在质谱中进一步裂解，主要裂解在-SO2-两端进行，实验数据和我们的实验结果相符（见图3）。但是对于m/z 65，文献报道该离子碎片是由S-N键和C-S键同时断裂生成离子HS·+O2

[24]。本研究运用ESI源也产生质荷比为m/z 65.03831的子离子，与HS·+O2（m/z 64.96918）质量误差为106 ppm，推断该子离子的分子式可能不是HS·+O2。从精确分子质量考虑，我们提出另一种质谱裂解方式：碎片离子m/z 65.03858是由子离子[C6H6N]+m/z 108.04439进一步裂解产生的[C5H5]+（见图2）。同时我们查找了具有苯胺结构的化合物的相关文献，发现该类化合物裂解时产生[C5H5]+m/z 65这一裂解碎片[27]。

图2 SAs的HCD裂解示意图

图3 15种SAs在HCD与CID模式下的质谱图比较（碰撞能量：55% eV）

磺酰胺N上连接不同的基团（R基）形成了不同的磺胺类化合物，除上述特征裂解途径外，失去R基也是磺胺类化合物的裂解途径之一，通过这种裂解途径可得到R基的信息。以磺胺-6-甲氧嘧啶（3）为例，m/z 281.07048是[M+H]+峰，在分辨率为30000时高分辨质谱测得的质量误差为0.7×10-6，符合最新的欧盟（SANCO/10684/2009）化合物确证指令。除共有的特征碎片离子外，磺胺-6-甲氧嘧啶还产生了其他丰度较高的碎片离子，这些碎片离子反映了R基的取代信息：离子碎片m/z 126.06624是SN键断裂后失去C6H5NO2S，正电荷保留在含N端产生的[C5H8N3O]+；碎片离子m/z 188.01265是C-S键断裂后，正电荷保留在含S端生成的[C5H6N3O3S]+；而碎片离子m/z 215.09287则是失去HSO2产生的[C11H11N4O]+（如图4所示）。

图4 磺胺-6-甲氧嘧啶的高能裂解推导（碰撞能量：55% eV）

表1 15种SAs在HCD与CID模式下的质谱碎片峰比较（碰撞能量：55% eV）

2.2 磺胺类化合物HCD裂解与CID裂解方式的比较比较HCD和CID两种裂解模式下的实验结果，发现HCD的裂解碎片更为丰富，改善了cut-off效应（如图3、表1所示）。以磺胺二甲嘧啶为例，当HCD和CID的碰撞能量均为55%时，CID裂解主要生成碎片离子m/z 186.03338、m/z 204.04393、m/z 124.08695和m/z 156.01135。推断其裂解机制为，CS键断裂生成[C6H8N3O2S]+m/z 186.03338，再经分子离子反应，加合一分子H2O后形成离子[C6H8N3O2S·H2O]+m/z 204.04393；S-N键断裂，生成[C6H6NSO2]+m/z 156.01135和[C6H10N3]+m/z 124.08695。HCD与CID相比，具有共同的碎片离子峰m/z 186.03320、m/z 204.04374、m/z 124.08684和 m/z 156.01135，都是在-SO2-基团两端进行的裂解。除此之外，HCD还生成了[C12H13N4]+m/z 213.11342、[C6H6NO]+m/z 108.04431、[C6H6N]+m/z 92.04939和[C5H5]+m/z 65.03837等离子。在相同碰撞能量的CID模式下未得到这些离子碎片，需做三级质谱扫描才能得到与HCD较为相似的裂解碎片信息。

3 结论

SAs是一类传统的合成抗菌药物，因其具有对氨基苯磺酰胺结构，在ESI正离子模式中产生[M+H]+分子离子，在HCD裂解过程中以-SO2-NH-基团为中心，发生S-N键的断裂，产生特征离子m/z 156.01138、m/z 108.04439、m/z 92.04948和m/z 65.03858。HCD二级质谱产生的特征碎片离子可作为磺胺类化合物的判断依据，而通过R基团断裂的碎片离子峰可以推测取代基的结构。与CID相比，HCD技术提供了稳定的高能裂解方式，并可改善CID裂解中产生的cut-off效应。HCD裂解模式结合高分辨质谱数据，为推测化合物结构、质谱裂解机制等提供更为详实的裂解碎片信息，为化合物的确证提供可靠的理论依据。该质谱裂解规律可以应用于SA及其类似物的质谱分析，对SA及其类似物的快速筛选鉴别、定量分析和药动学研究起到一定的参考作用。

[1] Pichler P, Kcher T, Holzmann J, et al. Peptide labeling with isobaric tags yields higher identification rates using iTRAQ 4-plex compared to TMT 6-plex and iTRAQ 8-plex on LTQ Orbitrap[J]. Anal Chem, 2010, 82(15): 6549-6558.

[2] Lu Y, Shen Q, Dai Z, et al. Development of an on-line matrix solid-phase dispersion/fast liquid chromatography/tandem mass spectrometry system for the rapid and simultaneous determination of 13 sulfonamides in grass carp tissues[J]. J Chromatogr A, 2011, 1218(7): 929-937.

[3] 孙庆庆, 王敏, 沈淑娇, 等. 三唑类席夫碱的绿色合成和生物活性研究[J]. 温州医学院学报, 2012, 42(3): 218-223．

[4] 谢自新, 张园, 蔡进章, 等. 菜头肾脂溶性成分研究[J]. 温州医学院学报, 2011, 41(4): 376-379．

[5] Liu X, Zhou Y, Chen H, et al. Detection of carbonyl groups in triterpenoids by hydroxylamine hydrochloride derivatization using electrospray ionization mass spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2008, 22(12): 1981-1992.

[6] Liu X, Li SL, Zhou Y, et al. Characterization of protostane triterpenoids in Alisma orientalis by ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2010,24(11): 1514-1522.

[7] Skrabáková Z, O'Halloran J, van Pelt FN, et al. Food contaminant analysis at ultra-high mass resolution: application of hybrid linear ion trap-orbitrap mass spectrometry for the determination of the polyether toxins, azaspiracids, in shellfish[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2010, 24(20):2966-2974.

[8] Godfrey AR, Williams CM, Dudley E, et al. Investigation of uremic analytes in hemodialysate and their structural elucidation from accurate mass maps generated by a multi-dimensional liquid chromatography/mass spectrometry approach[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2009, 23(19):3194-3204.

[9] Chi H, Sun RX, Yang B, et al. pNovo: de novo peptide sequencing and identification using HCD spectra[J]. J Proteome Res, 2010, 9(5): 2713-2724.

[10]Shen Y,Toliæ N, Xie F, et al. Effectiveness of CID, HCD,and ETD with FT MS/MS for degradomic-peptidomic analysis: comparison of peptide identification methods[J]. J Proteome Res, 2011, 10(9): 3929-3943.

[11]Bushee JL, Argika UA. An experimental approach to enhance precursor ion fragmentation for metabolite identification studies: application of dual collision cells in an orbital trap[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2011, 25(10): 1356-1362.

[12]Demesa Balderrama G, Meneses EP, Hernández Orihuela L,et al. Analysis of sulfated peptides from the skin secretion of the Pachymedusa dacnicolorfrog using IMAC-Ga enrichment and high-resolution mass spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2011, 25(8): 1017-1027.

[13]Sousa E, Olland S, Shih HH, et al. Primary sequence determination of a monoclonal antibody againstα-synuclein using a novel mass spectrometry-based approach[J]. Int J Mass spectrom, 2012, 312: 61-69.

[14]Monaci L, De Angelis E, Visconti A. Determination of deoxynivalenol, T-2 and HT-2 toxins in a bread model food by liquid chromatography-high resolution-Orbitrap-mass spectrometry equipped with a high-energy collision dissociation cell[J]. J Chromatogr A, 2011, 18(48): 8646-8654.

[15] Li JH, Liu X, Han S, et al. Analysis of ochratoxin A in wine by high-resolution UHPLC-MS[J]. Food Anal Methods,2012, 5 (6): 1506-1513.

[16] Liu X, Yang JL, Li JH, et al. Analysis of water-soluble azo dyes in soft drink by high resolution UPLC-MS[J]. Food Addit Contam, 2011, 28 (10): 1315-323.

[17] 严华, 刘鑫, 李建辉, 等. 氟喹诺酮类药物的高能诱导裂解高分辨质谱解析[J]. 检验检疫学刊, 2011, 21(增刊): 87-91.

[18]Kuki A, Nagy L, Memboeuf A, et al. Energy-dependent collision-induced dissociation of lithiated polytetrahydrofuran:effect of the size on the fragmentation properties[J]. J Am Soc Mass Spectrom, 2010, 21(10): 1753-1761.

[19]Volmer DA. Multiresidue determination of sulfonamide antibiotics in milk by short-column liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 1996, 10(13): 1615-1620.

[20]Wang Z, Hop CE, Kim MS, et al. The unanticipated loss of SO2from sulfonamides in collision-induced dissociation[J].Rapid Commun Mass Spectrom, 2003, 17(1): 81-86.

[21]Wang HY, Zhang X, Guo YL, et al. Sulfonamide bond cleavage in benzenesulfonamides and rearrangement of the resulting p-aminophenylsulfonyl cations: application to a 2-pyrimidinyloxybenzyl- aminobenzenesulfonamide herbicide[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2005, 19(12): 1696-1702.

[22]Klagkou K, Pullen F, Harrison M, et al. Approaches towards the automated interpretation and prediction of electrospray tandem mass spectra of non-peptidic combinatorial compounds[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2003, 17(11): 1163-1168.

[23]Barry SJ, Wolff JC. Identi fication of isobaric amino-sulfonamides without prior separation[J]. Rapid Commun Mass Spectrom, 2012, 26(4): 419-429.

[24]彭涛. 电喷雾串联质谱裂解规律及其在残留分析中的应用研究[D]. 中国农业大学, 2007.

[25] 马强, 王超, 王星, 等. 超高效液相色谱-串联质谱法同时测定化妆品中的22种磺胺类药物[J]. 分析化学, 2008, 36(12):1683-1689.

[26] 董丹, 邵兵, 吴永宁, 等. 液相色谱电喷雾串联四极杆质谱法测定鸡肉中17种磺胺类药物的残留[J]. 色谱, 2005, 23(4):404-407.

[27] 吴转璋, 丁健桦, 赖劲虎, 等. 纺织品中偶氮染料还原液内芳香胺的电喷雾电离质谱分析[J]. 岩矿测试, 2008, 27(4): 250-254.