福辛普利钠在大鼠肠道的吸收性质

孙筱，何璇，黄建耿，李高，斯陆勤 （华中科技大学同济医学院药学院，湖北 武汉430074）

福辛普利（fosinopril，又名蒙诺 Monopril）为血管紧张素转化酶抑制剂（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI），临床上常用于治疗高血压和充血性心力衰竭（CHF）。福辛普利几乎不溶于水，多用其钠盐以增加药物溶解度，但口服生物利用度也仅为32%～36%［1］。有报道，福辛普利是H＋依赖的寡肽转运体 Pept1 （H＋／peptide cotransporter）的底物［2］，Pept1的转运功能可能与其口服吸收密切相关。因此，深入了解福辛普利钠在大鼠肠道的吸收特性，对其新剂型的开发和制剂处方设计具有重要意义。本文拟建立测定大鼠肠灌流液中福辛普利钠含量的HPLC方法，并采用大鼠小肠单向灌流法考察福辛普利钠在大鼠肠道的吸收特性，探讨该药物吸收与Pept1之间的关系。

1 材料

1．1 仪器 Agilent1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Sepu3000工作站（杭州普惠科技有限公司）；TG16 W微量高速离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司）；DF－101s集热式恒温加热磁力搅拌器（河南省予华仪器有限公司）；多通道蠕动泵（德国Petro Gas Ausrüstungen Berlin公司）；DELTA320－pH计（上海梅特勒－托利多有限公司）。

1．2 试剂 福辛普利钠（武汉圣天宇科技有限公司，纯度＞99．6%，批号20101223）；甘氨酰肌氨酸（Gly－Sar，Sigma 公 司，纯 度 ＞ 95%，批 号100952752）；乌拉糖（中国医药集团上海化学试剂公司）；乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1．3 动物 雄性SD大鼠，体质量（250±50）g，华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（鄂）2004－0007。

2 方法

2．1 分析方法的建立

2．1．1 色谱条件 色谱柱：Eurospher C18柱（250 mm×4．0mm，5μm），预柱：C18保护柱（25 mm×4．6 mm，10μm），流动相：乙腈－水（30∶70，其中水相含0．3% 三乙胺，pH 值为 2．2）；检测波长：215 nm，流速：1．0mL·min－1，柱温：40℃，进样量：20μL。

2．1．2 方法专属性 取空白肠灌流液、福辛普利钠对照品溶液及实际灌流液样品考察肠液中各成分对福辛普利钠的测定是否有干扰。

2．1．3 标准曲线 精密称取福辛普利钠对照品适量于量瓶中，用甲醇溶解得福辛普利钠母液（4 mg·mL－1），分别取母液适量用空白肠灌流液稀释成终浓度为2．5，5，10，20，40，80μg·mL－1的标准曲线样品，并按“2．2．2”项下所述处理后进行 HPLC分析。以福辛普利钠浓度C为横坐标，药物峰面积A为纵坐标，采用最小二乘法进行回归计算，得标准曲线方程。

2．1．4 定量下限试验 福辛普利钠母液用空白肠灌流液稀释成终质量浓度为2．5μg·mL－1的样品，并按“2．2．2”项所述平行处理5份样品，进行HPLC分析，并根据当日标准曲线计算样品的测得浓度，计算相对误差（RE%）。

2．1．5 精密度和回收率试验 福辛普利钠母液用空白肠灌流液稀释成终质量浓度分别为5，20，40 μg·mL－1的样品，各取5份样品，按“2．2．2”项所述平行处理，连续测定3 d，以当日标准曲线计算样品的测得浓度。计算日内精密度和日间精密度以及方法回收率和样品提取回收率。

2．1．6 稳定性试验 福辛普利钠母液用空白肠灌流液稀释成终质量浓度分别为5，20，40μg·mL－1的样品，按“2．2．2”项所述平行处理5份样品。各浓度样品处理后于室温放置8 h、置－20℃ 冻存1 d以及37℃ 水浴4 h后分别测定，并根据当日的标准曲线计算含药样品的测得浓度，计算放置前后的相对误差。

2．2 大鼠小肠在体单向灌流试验

2．2．1 试验方法［3－5］大鼠禁食过夜，麻醉后打开腹腔，结扎胆管，分别在十二指肠、空肠、回肠两端插管，结扎。用K－R液（氯化钠7．0g，葡萄糖1．8 g，碳酸氢钠1．26 g，磷酸二氢钠0．234 g，磷酸氢二钠0．252 g，氯化钾0．34 g，氯化镁0．05 g，置1 L量瓶中，纯化水溶解并定容至刻度，0．1 mol·L－1盐酸调pH值为7．4）配制的药液平衡肠道30 min后，进口处用己知质量的装有供试液的小瓶灌流、出口处用己知质量的小瓶收集流出液，每10 min迅速更换供试、收集小瓶，称重，计算灌入液和收集液质量，试验共进行90 min，整个试验过程保持0．25 mL·min－1左右的恒定速度灌流。试验结束后，测量并记录所灌肠段的长度和内径。

试验考察的分肠段区间如下：十二指肠段自幽门1 cm处开始，空肠段离幽门15 cm开始，回肠段自盲肠上行20 cm开始，各分肠段均取约10 cm。

2．2．2 灌流样品的处理方法 取大鼠肠灌流液100μL，加入甲醇200μL，涡混3 min，13 000 r·min－1离心15 min，取上清液进样测定。

2．2．3 药物吸附性考察 配制含药40μg·mL－1的灌流液，同 “2．2．1”项试验方法但不插管大鼠肠段灌流连接管路2 h，比较灌流前后的药液浓度，考察试验管路和玻璃瓶对药物的吸附性。

2．2．4 肠道渗透系数Peff计算公式［6－7］依据下式计算药物的肠道有效渗透系数Peff：

其中，Qin为灌流液流入的流速（mL·s－1），Cout和Cin分别为肠道流出液、流入液的质量浓度（μg·mL－1），S为灌流肠段的内表面积（cm2），Vin和Vout分别为流入和流出的灌流液体积（mL），L为实验肠段的长度（cm），R为肠段半径（cm）。

2．3 统计学分析 数据均以±s表示。通过SPSS软件，多组间的比较采用ANOVA单因素方差分析；对两组间的比较采用双尾不配对的Student’st检验。P＜0．05时，认为差异有显著性。

3 结果

3．1 HPLC方法的建立

3．1．1 方法专属性试验 图1结果显示药物峰形良好，无肠液内源性物质的干扰。

图1 福辛普利钠HPLC专属性考察图谱Fig 1 HPLC specificity chromatograms of fosinopril sodium

3．1．2 线性关系考察 福辛普利钠的线性回归方程为Y＝9 440．7X－13 513，r＝0．999 2，福辛普利钠在2．5～80μg·mL－1范围内线性良好。

3．1．3 定量下限 福辛普利钠在定量下限为2．5 μg·mL－1时RSD小于5%，RE＜15%。

3．1．4 精密度及回收率 福辛普利钠低、中、高浓度样品的日内精密度RSD值均小于3%，日间精密度RSD值均小于9%，低、中、高3个浓度的样品方法回收率分别为 92．39%、96．58%、102．10%，提取回收率分别为 94．15%、97．19%、103．20%。见表1和表2。

3．1．5 稳定性 低、中、高浓度的样品处理后室温放置8 h、未处理样品 －20℃ 冻存1 d、37℃ 水浴4 h后药物均无显著变化，可准确测定。见表3。

表1 福辛普利钠精密度试验结果Tab 1 Results of precision test of fosinopril sodium

表2 福辛普利钠的回收率试验结果（n＝5）Tab 2 Recovery rate of fosinopril sodium（n＝5）

3．2 药物吸附性考察 灌流管路2 h后药物浓度为初始浓度的（101．1±2．0）%，表明试验管路和小瓶对药物无吸附作用。

3．3 福辛普利钠在大鼠不同肠段的吸收 用空白K－R液（pH7．4）配制40μg·mL－1的含药灌流液，按照“2．2．1”项下方法进行灌流，福辛普利钠在十二指肠、空肠和回肠的有效渗透系数Peff（×10－4cm·s－1，n＝6）分 别为 （1．5±0．4）、（1．15±0．26）和（0．91±0．14），且空肠和回肠与十二指肠之间差异均存在显著性（P＜0．05）。

3．4 灌流液pH值对福辛普利钠肠道吸收的影响分别配制pH 值为7．4，6．6，5．6的含药溶液进行灌流，结果见图2。福辛普利钠在不同肠段的渗透系数随灌流液pH值下降而增加；当pH值为5．6时，药物在各肠段的吸收与福辛普利钠在pH7．4时相比差异均有显著性（P＜0．05）。

3．5 不同浓度Gly－Sar对福辛普利钠肠道吸收的影响 Pept1的典型底物Gly－Sar对福辛普利钠肠道吸收的影响见图3。当二肽浓度为0．144 mmol·L－1时，对药物在十二指肠的吸收有极显著性促进作用（P＜0．01），但如进一步提高二肽浓度，则药物的吸收呈下降趋势，当浓度为3．59 mmol·L－1时，三段肠对药物的吸收与0．072 mmol·L－1或0．144 mmol·L－1时相比均出现显著性差异（P＜0．05）。

表3 福辛普利钠稳定性试验（n＝5）Tab 3 Stability of fosinopril sodium（n＝5）

4 讨论

由于福辛普利钠的最大紫外吸收处于较低波长处，其生物样品的测定易受内源性杂质的干扰。在预试验中发现，肠灌流液样品采用甲醇沉淀蛋白后杂质峰可明显少于乙腈；降低流动相的pH值可显著改善峰型，但同时会使杂质峰增加；此外，加入适量的三乙胺也可显著改善药物峰型。采用本文所建立的HPLC条件对福辛普利钠大鼠肠灌流液进行测定，其方法简单、灵敏、可靠，精密度、准确度和稳定性均可满足生物样品测定的要求。

福辛普利钠在大鼠近端小肠的吸收明显高于远端，这与Pept1在大鼠小肠的分布密度从小肠近端至小肠远端逐渐降低的报道相一致［8－9］。随着灌流液pH值的降低，药物在大鼠各肠段的有效渗透系数均呈增大趋势，且pH值越低增加越显著，这可能是因为Pept1是一种H＋同向协同的寡肽转运蛋白［10］，pH值的降低可为Pept1提供更多的 H＋，从而促进了Pept1的转运功能。Gly－Sar是Pept1的专属性底物，本研究结果表明Gly－Sar对福辛普利钠的吸收呈现随浓度增加先促进后抑制的趋势。低浓度的二肽具有促进福辛普利钠的肠道吸收的作用，此现象可能与Gly－Sar促进细胞顶膜的Pept1肽转运体蛋白表达，从而增加福辛普利钠的肠道转运有关。在Shiraga等［11］进行的研究中发现二肽可与Pept1基因启动子上的氨基酸敏感因子之间产生相互作用，提高Pept1 mRNA的转录活性，从而上调Pept1的蛋白表达。Walker等［12］在采用Gly－Sar处理Caco－2细胞24 h后，经 Western印迹法分析也发现Pept1的蛋白表达水平增加了近2倍。但当二肽浓度进一步增大时，二肽则可能与福辛普利钠共同竞争Pept1转运体的转运位点，从而使底物药物的吸收减少。虽然Gly－Sar对福辛普利钠肠道吸收影响的分子机制还有待进一步的研究进行确证，但通过本文的研究可见影响Pept1活性的因素均可能会使福辛普利钠的肠道吸收发生变化，福辛普利钠在大鼠肠道的吸收易受到Pept1的表达丰度、肠腔pH值以及其他Pept1底物的影响。

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