大鼠胰岛复合猪小肠黏膜下层体外构建组织工程胰腺的实验研究

宋勇 薛武军 田普训 丁小明 冯新顺 田晓辉 宋焕瑾 李杨

目前治疗1型糖尿病的主要方法有胰岛素注射、胰腺移植和胰岛移植。胰岛移植是治疗胰岛素依赖型糖尿病(insulin dependant diabetes mellitus，IDDM)的一种最符合生理需求且有效的方法，它是将外源性具有生理功能的胰岛细胞移植于患者，实现全内分泌替代治疗，通过对血糖进行持续监测和精细调节，以更接近人体自身生理的方式，使糖代谢恢复正常而不增加低血糖的发生率，从而防止或减缓心、肾和眼等病变的发展。尽管胰岛细胞移植已取得很大进展，但仍无法在临床大规模应用，这主要是由于胰岛移植仍存在一些问题。其中主要的是宿主免疫排斥反应。同时，由于胰岛本身是一个无血管的移植物，在其重建血管化的几天内很容易因缺乏营养而窒息死亡。因此如何提高胰岛移植后的活性成为胰岛移植研究的一个重点。

组织工程技术的发展使人工胰腺发展迅速，为胰岛移植提供了更多方法。目前存在的一些无免疫抑制剂胰岛移植技术（例如微囊化胰岛和大包囊胰岛等）为胰岛移植提供了新的思路。本研究自2008年5月至2009年3月利用猪小肠黏膜下层（small intestinal submucosa，SIS）与组织细胞有良好的组织相容性特点[1]，用其作支架材料重建胰岛营养支持的微环境，改善胰岛存活，旨在探讨将两者体外复合培养构建组织工程胰腺的可行性，为其体内胰腺移植使用打好前期基础。

材料与方法

一、实验动物与主要仪器试剂

供体均为雄性远交群（sprague dawley，SD）大鼠，体重200～280 g，由西安交通大学实验动物中心提供。其他试剂和仪器包括：Ⅴ型胶原酶（美国Sigma公司），RPMI 1640培养基（美国Hyclone公司），OLYMPUS相差显微镜，低温离心机（美国Thermo Forma公司），扫描电镜（荷兰FEIQuanTa 200 Philips），透射电镜（日本 JEM-200CX），新生牛血清（杭州四季青生物制品公司），双硫腙（dithizone，美国Sigma公司），胎牛血清（美国Hyclone公司），Hank缓冲液（美国Sigma公司），Ficoll液（美国Sigma公司），6孔培养板（美国Corning公司）和丫啶橙（acridine orange,AO）/碘化丙啶（propidium iodide,PI）（美国 Sigma公司）。

二、SIS的制备

1.物理方法：取屠宰4 h内的新鲜猪小肠，将小肠的浆膜层和肌层用裹有纱布的刀柄去除，用40℃水持续冲洗干净。

2.化学方法：参考Abraham方法[2]把用物理方法处理的小肠在室温下经过一系列化学方法处理，材料与溶液的体积比例保持在1:100。（1）将机械方法制得的SIS浸泡在含有100mmol/L乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)和10mmol/L NaOH 溶液中(pH 11～12) 16 h；（2）用去离子水将基质冲洗干净，在含有1mmol/L HCl和1mmol/L NaCl溶液中(pH 0～1)浸泡6～8h；（3）用去离子水冲洗基质后，在1mmol/L NaCl的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer，PBS)中浸泡 16 h ；（4）用去离子水冲洗基质后，在PBS溶液中(pH 7.0～7.4)浸泡2h；（5）再用去离子水冲洗基质2h(pH 5.8～7.0)；（6）杀菌：将SIS在含0.1﹪的过氧乙酸的20﹪乙醇溶液中浸泡8h，用含0.05﹪叠氮化钠的PBS溶液清洗2h，-70℃冻干，γ射线照射(25～35 kGy)灭菌。

三、改良的胰岛分离、纯化与培养

1.胰腺的获取：按2﹪戊巴比妥钠120 mg/kg行SD大鼠腹腔注射麻醉，无菌条件下剖腹，显露胆总管。于胆总管上端剪一小口并插入5号头皮针，结扎固定，夹闭胰管远端与小肠汇合处。剪破心脏处死大鼠，胆总管内缓慢注入1.5 mg/mlⅤ型胶原酶使胰腺膨胀，完整剪下胰腺放入Hank缓冲液10～12ml。

2.胰岛的分离：将剪下的胰腺于38℃水浴震荡器中放置10～15min，以100次/min振荡2～3min，于4℃将未消化完全的胰腺撕碎，人工振荡20～40次，加入冷Hank液至50ml，80目网筛过滤。滤至预冷的加有灭活胎牛血清的Hank乳酸钠林格氏液中，以终止消化。为了减少消化过程对胰岛的损伤，在终止消化的Hank乳酸钠林格氏液中均加入了牛血清白蛋白[3-4]。消化液于4℃，离心半径13.5 cm，1000 r/min平衡离心1～2min，弃上清液，冷Hank液再洗涤离心1次，终止消化。

3.胰岛的纯化：将上述制备的沉淀物用Hank液再离心洗涤1次，将25﹪ Ficoll溶液4ml与需纯化的胰岛细胞充分混匀，放置于离心管底部，再依次加23﹪、20﹪和11﹪的Ficoll溶液各2ml，4℃离心半径13.5 cm，2000 r/min离心15min后，吸出20﹪～23﹪界面的细胞，洗涤后培养于RPMI1640培养液(含10﹪的胎牛血清)中。

四、胰岛与SIS复合体体外构建胰腺

将胰岛以5.0×105个/孔密度接种于6孔培养板，每孔加2 cm×2 cm SIS材料1块。在37℃的5﹪CO2饱和湿度条件下复合培养，每3天更换1次培养液。一定时间后取出SIS用于观察及检测。

五、相差显微镜观察

逐日在相差显微镜下观察培养基有无混浊、细胞生长及与生物材料附着情况和SIS形态变化。

六、AO/PI双染色

将适量AO、PI分别溶于Dulbecco乳酸钠林格氏液中，使AO的终浓度为670 μmol/L，PI的终浓度为750 μmol/L。临用前取0.01ml AO与1ml PI混合，用Dulbecco乳酸钠林格氏液稀释10倍，用0.22 μm滤膜过滤除菌，然后将胰岛避光染色10min，在荧光显微镜下用429 nm激发光激发，可看到呈绿色荧光的活细胞；使用555 nm激发光激发，可看到呈红色荧光的死细胞。

七、生物学活性测定

胰岛素释放试验：用Hank液分别配制浓度为3.3mmol/L的低糖培养液和16.7mmol/L的高糖培养液。纯化后的60个胰岛置于低糖培养液中，在37℃的5﹪CO2培养箱中孵育4 h，然后用高糖培养液置换低糖培养液，再孵育4 h，分别收集上清液用放射免疫法测定胰岛素含量。

八、扫描电镜观察

将胰岛与SIS复合培养分别于培养第3、5、7、10天及2周将培养孔内生物材料取出，2.5﹪戊二醛固定，系列丙酮中脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥，表面喷金后上机观察骨髓间充质干细 胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）在SIS上的附着与生长情况。

九、透射电镜观察

将胰岛与SIS复合培养3、5、7、10d及2周后，2.5﹪戊二醛固定，系列丙酮中脱水，浸透及环氧树酯包埋，超薄切片机切片，醋酸铀-柠檬酸铅双染色，透射电镜观察BM-MSCs中的细胞器变化情况。

十、统计学分析

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学处理。胰岛素测定结果用表示，组间差异用独立t检验分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、相差显微镜观察培养细胞

SIS复合胰岛培养时，2～4 d培养期内胰岛变化不明显，单纯培养的胰岛细胞团呈裂解小块或不规则形。SIS复合培养胰岛在第7天后材料周围有较多胰岛直接贴附于材料边缘，10d后大量细胞聚集材料边缘(图1a)，多为椭圆，边界清晰，DTZ染色为猩红色，凋亡减少(图1b)。

二、AO/PI双染色

大部分胰岛细胞团呈绿色，表明细胞的活性良好，计算多个视野细胞的存活率，平均存活率92﹪(图1c)。

图1 相差显微镜观察培养的胰岛细胞

三、胰岛素测定

从纯化后的胰岛中挑选60个，分别在6孔板进行单纯培养和SIS共培养3 d，采用低糖及高糖刺激，并测定不同条件下胰岛素分泌情况。低糖情况下胰岛素分泌量为( 22.35±3.43 )mmol/L，高糖情况下为( 37.79±4.27 )mmol/L，两者差异有统计学意义( t=21.84，P=0.00 )(表1)。

表1 SIS组和对照组胰岛素释放结果(mmol/L，)

表1 SIS组和对照组胰岛素释放结果(mmol/L，)

注：SIS为小肠黏膜下层

组 别 低糖下胰岛素(3.3mmol/L)高糖下胰岛素(16.7mmol/L) t值 P值SIS组 22.35±3.43 37.79±4.27 21.840 0.000对照组 21.45±2.38 28.67±3.58 13.009 0.000 t值 1.670 12.678 P值 0.098 0.000

四、扫描电镜观察

体外复合培养时，在SIS光滑面生长的胰岛粗糙面较少。复合培养5 d，细胞散在材料表面，呈长梭形或不规则形，细胞间无连接。胞体表面有颗粒状物，可见微丝形成并附着在材料表面(图2a)。培养7 d后细胞数量明显增多，细胞分泌旺盛，细胞间有大量胶原纤维丝，形成细胞间连接。部分细胞跨越孔隙，呈长梭形，有些正在分裂，有些重叠生长。培养10d后胰岛呈三维生长(图2b)。

五、透射电镜观察

胰岛在SIS上呈多层生长，细胞连接紧密。胞体成梭形，膜表面有微绒毛状突起，细胞核呈梭形或不规则形，偶见有分叶形，粗面内质网丰富、扩张和增粗，有大量异噬体等次级溶酶体，线粒体体积较小，高尔基氏体可见小囊泡，细胞间基质致密。随培养时间延长，靠近SIS表面的细胞粗面内质网数量较最上层细胞少，细胞出现老化现象。培养2周后靠近SIS的内层细胞老化更明显(图2c)。

讨 论

组织是由细胞与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)构成的。ECM是细胞微环境的主要成分，不仅为各种细胞提供骨架结构与附着位点，而且在细胞的黏附、迁移、增殖、分化、组织特异性维持和凋亡诱发相关基因表达抑制等方面发挥着重要作用。不仅如此，ECM由细胞分泌，反过来又对细胞的增殖分化起着支持与诱导作用。胰岛基膜由Ⅳ型胶原、层黏连蛋白和纤连蛋白组成[5]。胰岛的分离和纯化过程不仅破坏间质，也使胰岛周围的基质遭到破坏。基于此，本研究尝试将胰岛放置于包被天然ECM材料(如SIS)的培养板上进行培养，力图重构原有ECM结构，恢复细胞功能。在组织工程中，种子细胞的功能有赖于ECM的存在。有了合适的ECM替代物，组织就可能完全再生。

图2 图a为扫描电镜下猪小肠黏膜下层复合培养大鼠胰岛细胞5 d 后胰岛细胞散在材料表面，呈长梭形或不规则形，细胞间无连接（×900）；图b为扫描电镜下猪小肠黏膜下层复合培养大鼠胰岛细胞10d 后胰岛细胞间微丝连接，呈三维生长（×900）；图c为扫描电镜下猪小肠黏膜下层复合培养大鼠胰岛细胞14 d 胰岛粗面内质网数量较少（×1000）

研究已经表明，支架材料表面的化学和物理性能会影响种子细胞的黏附和增殖[5]。因此，组织工程的理想支架材料除了有良好的组织相容性，没有抗原作用，有一定的孔隙率和机械强度，降解性和降解速率可以控制以外，还必须能够维持在其上面生长的细胞形态和表型，增进细胞的黏附和增殖，诱导组织的再生。SIS是一种天然ECM生物材料，含有活性生长因子，较其他用于组织工程的合成材料(如聚乳酸)优越。McDevitt等[6]从SIS中提取出转化生长因子-β，尽管在制备过程中经受过消毒和冻干等处理，仍具有生物活性[7]，既可以促进间充质细胞分化和增殖，又能刺激成骨细胞和成软骨细胞增殖，增加Ⅰ型胶原、骨连接蛋白和骨桥蛋白合成[8]。Hodde等[9]也证实SIS的ECM中有血管内皮生长因子，以及与促内皮细胞分裂素有密切关系的血小板源生长因子。SIS所固有的这些生长因子，在组织的修复和重构中有着重要的促进作用。

在胰岛的体外培养研究中，多年来一直采用二维静态培养，由于培养器皿中氧气、营养物质及代谢产物分布的不均匀性，且由于胰岛的团状结构，其活性会因营养及氧气缺乏而迅速降低。随着空间生命科学的发展，已建立起来的一种三维立体培养体系，它通过细胞生物支架培养液与细胞的有机结合，使培养细胞始终处于一种立体三维状态，使培养体系中营养及代谢产物分布更加均匀，气体交换更加充分，从而防止胰岛细团内部的细胞因缺乏氧气和营养而坏死。SIS模拟细胞外微环境，可以促进胰岛的正常转化和再组织化，从而构建肉眼可见的、组织样三维结构。无论是实验还是临床，都曾用SIS作材料进行组织缺损的修复[9]。实验表明，经过长达2周的培养，胰岛分泌胰岛素的功能仍很活跃，细胞融合后接触抑制不明显，并且在SIS上重叠生长。

本研究证实，利用SIS制作的三维支架材料具有空间定位，可供细胞迁移，与胰岛在体外复合培养时，细胞在支架的表面附着良好。随着换液和培养时间的延长，SIS上胰岛同时可以附着于材料的孔隙周边或深入材料孔隙内生长，复合组织逐渐变厚，这就为开展组织工程胰岛的临床移植奠定了实验基础。本研究结果提示，随着培养时间的延长，底层细胞的活力比上层细胞的活力减弱。因此，选择植入体内的合适时间将是下一步研究的内容之一。总之，将分离后的胰岛细胞与SIS共培养能够较好的维持胰岛的生物学功能和活力，使胰岛细胞移植成为更理想的糖尿病治疗措施。

1 张开刚,曾炳芳,张长青.小肠黏膜下层的制备及细胞相容性的实验研究[J].中华创伤骨科杂志,2004,7(4):344-348.

2 Abraham GA,Murray J,Billiar K,et al.Evaluation of the porcine intestinal collagen layer as a biomaterial[J].J Biomed Mater Res,2000,51(3):442-452.

3 Vajkoczy P,Menger MD.Improved islet isolation by 10﹪ albumin does not influence graft angiogenesis and vascularization[J].Exp Clin Endocrinol Diabetes,1997,105(3):152-155.

4 Field J,Farney A,Sutherland DE.Improved islet isolation from rat pancreas using 35﹪ bovine serum albumin in combination with dextran gradient separation[J].Transplantation,1996,61(10):1554-1556.

5 杨志明.组织工程基础与临床[M].成都：四川科学技术出版社，2000:62-67.

6 McDevitt CA,Wildey GM,Cutrone RM.Transforming growth factor- beta in a sterilized tissue derived from the pig small intestine submucosa[J].J Biomed Mater Res A,2003,67(2):637-640.

7 Hodde JP,Hiles MC.Bioactive FGF-2 in sterilized extracellular matrix[J].Wounds,2001,13(5):195-201.

8 Noda M.Transcriptional regulation of osteopontin production in rat osteosarcoma cells by type beta transforming growth factor[J].J Biol Chem,1988,263(27): 13916-13921.

9 Hodde JP,Record RD,Liang HA,et al.Vascular endothelial growth factor in porcine-derived extracellular matrix[J].Endothelium,2001,8(1):11-24.