热瘀散对溃疡性结肠炎胃肠湿热型大鼠模型细胞因子影响的研究

王翼洲 杨 辉 杨桂芳 柳 雯

（安徽中医学院第一附属医院，安徽 合肥 230031）

本实验组自拟经验方热瘀散治疗溃疡性结肠炎（UC）取得肯定疗效，尤其适用于轻、中度UC，效果显著。但鉴于本病病因病机至今尚不十分清楚，故通过建立UC胃肠湿热型大鼠模型，利用热瘀散高、低剂量组进行治疗，并设立相关对照组，选择以上血清学细胞因子进行检测后比较，以探讨热瘀散治疗该病的作用机制，并探讨UC的发病机制。

1 材料与方法

1.1 药物 热瘀散组成为：黄芪15g，白术12g，茯苓 12g，黄芩15g，黄连 9g，败酱草 30g，丹参 15g，三七粉 3g，赤芍 15g，木香9g，白芍12g，炙甘草6g；由广东一方制药有限公司生产的颗粒剂组方，由安徽省中医院药剂科提供。

1.2 动物 wistar大鼠，体质量150～180g，雄性，由安徽医科大学动物中心提供（合格证号：XK苏2002-0025）。

1.3 试剂与仪器 2，4，6-三硝基苯磺酸 （TNBS，Sigma公司产品）的30%（体积分数）乙醇溶液，20%氨基甲酸乙酯。NO试剂盒为北京邦定生物公司产品。超氧化物歧化酶（SOD）放射免疫分析试剂盒，由北京北方生物技术研究所提供。白细胞介素（IL）-6放射免疫试剂盒，由北京北方生物技术研究所提供。丙二醛（MDA）测定试剂盒：南京聚力生物医学工程研究所提供。高速组织匀浆仪（德国JANKE&KUNKEL GMBH公司）。GL-20A型高速冷冻离心机（湖南仪器仪表总厂离心机厂）。UV-260型可见紫外分光光度计（日本岛津公司）。光学显微镜（日本Olympus AHBT-5B）。LRH-800-GS人工气候箱为广东省医疗器械厂产品。YC-DZOZ亚都超声加湿器为北京亚都科技股份有限公司产品。电光分析天平，由上海天平仪器厂提供。纯LBYN5A型旋转式血流变仪（北京普利生仪器有限公司）。

1.4 分组与造模 将大鼠随机分成正常对照组、模型对照组、热瘀散高剂量组、热瘀散低剂量组、柳氮磺胺吡啶（SASP）组。除正常对照组外，其余各组参照文献［1-2］的方法建立UC胃肠湿热型大鼠模型。将禁食12h动物，20%氨基甲酸乙酯腹腔注射麻醉，6mL/kg，将一直径2.0mm长约12cm的橡胶输液管，由肛门轻缓插入深约8cm，按100mg/kg质量浓度的三硝基苯磺酸（TNBS）推入结肠，每只0.5mL，让动物保持平躺自然清醒。麻醉大鼠自然清醒后，将大鼠饲以高脂高糖饮食，即在普通饲料喂养的基础上，加用200g/L蜂蜜水自由饮用，且隔日按大鼠体质量灌服油脂10g/kg，并与油脂隔日灌服10mL/kg白酒，共10d，然后放入温度（32±2）℃，相对湿度为95%的人工气候箱中，共5d。

1.5 给药方法 完成造模后，热瘀散高剂量组予8g/kg灌胃，热瘀散低剂量组予2g/kg灌胃，SASP组经口灌胃给予SASP 66.7mg/（kg·d）（按人常用剂量的5倍量换算），各组灌胃给药均每日1次，连用15d；同时，模型对照组及正常对照组作常规饲养料理。

1.6 标本采集与检测 留取标本进行血清学相关细胞因子检测。包括 NO、IL-6、SOD、MDA、IL-8、IL-10、IL-13、肿瘤坏死因子（TNF）-α指标测定，测定方法按测定试剂盒说明书的方法进行。大鼠行腹主动脉取血，离心10min取血清待测。（1）SOD测定：采用微量快速测定法，取肝素抗凝血100μL加入盛有5mL生理盐水的刻度离心机中，2000r/min离心10min，弃尽上清液，加预冷双蒸水0.2mL、95%乙醇0.1mL、三氯甲烷0.1mL，振摇片刻，3000r/min离心10min，取上清液，再按试剂盒要求测定。（2）MDA测定：含量采用TBA比色法测定。利用MDA与硫代巴比妥（TBA）缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰，以四乙氧基丙烷为MDA标准品，取0.1mL血清，在与标准曲线相同的条件下反应，用比色法测定各管吸收光值。按公式计算MDA的含量。MDA （μmoL/g）=（测定管吸光度-测定空白管吸光度）/（标准管吸光度-标准空白管吸光度）×标准品浓度×样本测试前稀释倍数。（3）NO测定：南京建成生物工程有限公司试剂盒，采用酶标法高密度测定（ELISA）。设置测定管与标准管。测定管样品 0.1mL，试剂 10.1mL，试剂 20.1mL，轻轻混匀，37℃水浴 1h，另加试剂30.5mL，试剂40.5mL混匀，室温放置10min后，530nm波长处测定OD值，计算NO含量。IL-6的测定：采用双抗体夹心ELISA法测定，具体按IL-6试剂盒说明书操作。（4）IL-8、IL-10测定：采用双抗体夹心ABC-ELISA法，具体按试剂盒说明书操作。（5）TNF-α、IL-13 测定：采用酶联免疫吸附法（ELISA），具体按试剂盒说明书操作。

1.7 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行统计学分析，连续型变量用（）表示，组间均数比较采用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 热瘀散对血清MDA、SOD、IL-6、NO的影响 见表1。与正常对照组比较，模型对照组SOD含量均显著减少，MDA、IL-6、NO含量明显增多 （P＜0.01）；SASP组及热瘀散各组均能升高SOD含量，降低MDA、IL-6、NO含量，尤以热瘀散高剂量组效果明显，与SASP组比较有显著差异（P＜0.01）；SASP组及热瘀散低剂量组，与模型对照组比较有显著差异（P＜0.01）；热瘀散低剂量组与SASP组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组血清 MDA、SOD、IL-6、NO 水平比较（）

表1 各组血清 MDA、SOD、IL-6、NO 水平比较（）

与正常对照组比较，*P＜0.01；与模型对照组比较，△P＜0.01；与SASP对照组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。下同。

组别 n MDA（μmoL/g） SOD（U/mg） IL-6（pg/mL） NO （μmoL/g）正常对照组 10 23.44±1.9 785.11±15.56 52.28±9.57 196.43±3.95模型对照组 10 47.72±5.17* 53.23±11.78* 86.36±10.26* 382.13±9.93*热瘀散高剂量组 10 26.92±2.94△▲▲ 76.23±11.78△▲▲ 49.97±8.67△▲▲ 264.07±9.84△▲▲热瘀散低剂量组 10 33.03±2.57△ 61.78±12.33△ 69.34±9.37△ 303.61±3.71△SASP 组 10 34.91±2.97△ 60.16±13.16△ 70.22±9.93△ 315.11±29.12△

2.2 热瘀散对血清IL-8、IL-10的影响 见表2。与正常对照组比较，模型对照组IL-8表达显著增高，IL-10表达显著降低（P＜0.01）；与模型对照组比较，各治疗组IL-8显著降低，各治疗组IL-10表达均有不同程度回升 （P＜0.01）；热瘀散高剂量组与SASP组比较，虽然高剂量组IL-8表达略低于SASP组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；热瘀散高剂量组较SASP组IL-10表达增高（P＜0.05）；热瘀散低剂量组与SASP组相比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组血清 IL-8、IL-10 含量比较（pg/mL，）

表2 各组血清 IL-8、IL-10 含量比较（pg/mL，）

组 别 n IL-8 IL-10正常对照组 10 34.847±3.985 111.111±5.369模型对照组 7 58.798±3.048* 69.203±6.374*热瘀散高剂量组 9 41.074±3.009△ 96.663±3.431△▲热瘀散低剂量组 8 49.692±3.183△ 85.701±3.572△SASP 组 8 41.694±3.261△ 89.587±5.202△

2.3 热瘀散对血清TNF-α、IL-13的影响 见表3。与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清TNF-α表达水平显著增高，IL-13表达水平显著降低（P＜0.01）；与模型对照组相比较，各治疗组大鼠血清TNF-α水平显著降低，IL-13表达水平显著升高 （P＜0.01）；热瘀散高剂量组与SASP组比较，虽然高剂量组TNF-α表达略低于SASP组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；热瘀散高剂量组较SASP组IL-13表达水平显著增高（P＜0.05）；热瘀散低剂量组与SASP组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组TNF-α、IL-13 水平比较（pg/mL，）

表3 各组TNF-α、IL-13 水平比较（pg/mL，）

组 别 n TNF-α IL-13正常对照组 10 49.27±1.98 126.39±3.95模型对照组 7 75.62±3.12* 78.98±4.92*热瘀散高剂量组 8 58.63±1.06△ 105.67±4.16△▲热瘀散低剂量组 8 67.82±3.18△ 94.26±3.82△SASP对照组 8 59.05±2.15△ 97.15±2.91△

3 讨 论

笔者认为，UC的病机主要是脾虚为本，湿热为因，血瘀是UC的重要环节，故以益气健脾，清热利湿，活血化瘀为治疗大法。热瘀散方中黄芩、黄连清热燥湿、泻火解毒，两药相须为君；黄芪益气健脾利湿，白术补气健脾、燥湿利水，与黄芪配伍以加强益气健脾之功效，赤芍、丹参、败酱草清热化瘀止痛，木香行气止痛，茯苓利水渗湿，共为臣药；佐以白芍调和肝脾、缓急止痛，尚有敛阴和营之效，防清热利湿太过，三七粉活血化瘀止痛，亦为佐药；甘草炙用以益气补中、缓急止痛，并能调和诸药，是兼佐使之用。诸药合用共达益气健脾，清热利湿，活血化瘀之功。

本实验结果表明，热瘀散能显著提高胃肠湿热型大鼠模型SOD活性，同时降低MDA含量，对UC有明显的治疗作用，其作用机制可能是SOD能有效地清除氧自由基从而抑制肠组织中的脂质过氧化反应，并能稳定细胞膜，提高机体抗自由基损伤的能力。过多产生的NO易在氧自由基存在时转变为过氧化亚硝酸，并通过自由基链式反应导致含巯基的蛋白和脂质氧化，从而造成组织损伤。本实验结果表明热瘀散能降低NO含量，减轻NO的杀伤毒性及其对组织细胞的损伤作用，减轻炎症反应，促进溃疡愈合。UC患者IL-6水平明显升高可与TNF-α和IL-1α相互作用，导致UC活动期的特征性炎症反应。IL-6含量的增高使大量的T细胞尤其是CD4+T细胞迅速分裂增殖，形成致敏淋巴细胞，又可活化粒细胞，增强NK细胞及LAK细胞杀伤力，从而增进炎症反应。有实验研究［3］结果显示，通过观测患者IL-6活性，可以反映疾病的活动度及其转归。热瘀散能降低IL-6含量，从而减轻炎症反应，改善机体的免疫功能，促进溃疡愈合。IL-8升高程度与局部炎症程度相一致，可作为UC早期诊断指标，对UC严重程度判断有一定指导意义［4-5］。热瘀散能降低IL-8含量，从而减轻炎症反应，改善机体的免疫功能，促进溃疡愈合。IL-10为Th2型细胞分泌，在黏膜免疫中是一种重要的细胞因子调节剂，在肠道黏膜内环境稳定中发挥重要作用。Linehan等［6］认为IL-10抑制诱生型一氧化氮合酶（iNOS）的表达。目前各种针对补充IL-10的UC免疫治疗在模型动物和临床实验中也都取得了良好效果［7］。所以，IL-10对有效判断UC的病情程度有重要意义。本实验结果表明热瘀散能提高IL-10含量，从而减轻炎症反应，改善机体的免疫功能，促进溃疡愈合。TNF-α被公认为介导UC的细胞因子，属于促炎因子。诸多报道显示UC患者TNF-α分泌水平高于正常组或未受累结肠黏膜［8］。本实验结果表明热瘀散能降低TNF-α、提高IL-13水平，从而减轻炎症反应，改善机体的免疫功能，促进溃疡愈合。

综上所述，主要通过中药清热化湿，益气健脾，兼有活血化瘀作用，从而调节大鼠模型的免疫反应，减轻促炎因子的作用，增强抑炎因子的作用，以减轻甚至控制炎症反应，以发挥疗效。本实验结果则又进一步证实UC的发病机理中，氧自由基诱发的脂质过氧化反应起着重要的作用。为免疫反应系UC发病的病机之一提供依据。

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