肌醇需求酶1（IRE1）激酶抑制剂高通量筛选模型的建立

张坤智， 苏明波，， 周宇波

（1.华东师范大学 生命科学学院，上海 200062；2.国家新药筛选中心，上海 201203）

0 引 言

IRE1是定位在内质网膜上的单次跨膜蛋白，具有丝氨酸／苏氨酸激酶和核酸酶双重功能，是未折叠蛋白应答（UPR，unfolded protein response）中进化最保守、最重要的通路［1］.IRE1蛋白一方面可以感知内质网压力，使激酶区域自磷酸化进而激活核酸酶活性，在mRNA水平上剪切其下游转录因子XBP1［2］.另一方面，激活的IRE1还可以通过不依赖于XBP1的途径，招募JNK，进而引发细胞凋亡［3］.

IRE1作为激酶／核酸酶双功能酶，其激酶与核酸酶之间的关系为人们所关注.有的研究认为IRE1激酶自身磷酸化对IRE1核酸酶的活性是必需的［4］；有研究认为IRE1核酸酶活性与激酶活性的有无之间没有必然联系［5］，还有一些研究认为抑制IRE1激酶的活性反倒能够激活其核酸酶活性［6］.到底IRE1激酶与核酸酶之间有怎样的联系，尚不甚清楚.

IRE1参与调解机体的许多生理功能，在细胞的生长、分化、代谢等诸多生命活动中起着很重要的作用.活化的IRE1参与胰高血糖素对肝脏多种代谢途径的调节，抑制IRE1通路则显著改善血糖水平并提高机体的葡萄糖耐受能力［7］，整个过程与XBP1无关，提示IRE1激酶活性可能参与这一调控.最新的报道则指出IRE1依赖于其激酶活性促进突变型亨廷顿蛋白的积累，从而加重亨廷顿舞蹈症［8］.IRE1在肿瘤低氧、低糖的微环境中促进了血管内皮生长因子的表达，扩张肿瘤血管使得恶性神经胶质瘤能持续生长［9，10］.但这一过程究竟是IRE1激酶还是IRE1核酸酶发挥作用，尚不清楚.

基于以上所述，IRE1不仅具有重要的生理功能，而且与包括代谢性疾病、神经退行性疾病以及肿瘤等重大疾病有着密切关系，但目前在IRE1化学生物学方面的研究工作特别是IRE1激酶抑制剂研究还非常少，极大程度的限制了进一步准确理解IRE1生理功能及其与疾病的关系研究.IRE1激酶小分子抑制剂的发现，不仅对验证IRE1激酶活性与疾病关系及潜在的药物发现及其作用机理提供研究思路与平台，也对阐明激酶与核酸酶之间的关系也提供了研究工具.本项目拟从IRE1激酶活性调控入手，建立体外的IRE1激酶抑制剂高通量筛选模型，为进一步发现IRE1激酶抑制剂奠定坚实基础.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

质粒IRE1 alpha－pcDNA3.EGFP（Genbank Number：NM＿001433.3）购自 Addgene公司，pFAST－Bac1来自本实验室保存，大肠杆菌JM109和DH5α来自本实验室保存，各种限制性内切酶，T4 DNA连接酶以及PCR试剂为Takara公司产品，PCR回收以及胶回收试剂盒为Axygene产品，PCR管购自Promega公司，质粒抽提试剂盒购自TIANGEN公司、OMEGA公司以及Nucleobond公司，Sf9和Hi－5细胞来自本实验室保存，转染试剂Cellfectin购自Invitrogen公司，Bluo－gal IPTG，GIBCO Grace昆虫培养基，Bac－to－Bac杆状病毒表达系统，GIBCO胎牛血清，sf－900ⅡSFM昆虫培养基均购自Invitrogen公司，HTRF试剂盒购自Cisbio公司，白色384圆孔板购于PE公司，星形孢菌素（sc－3510A）购于Santa Cruz公司，显微镜为OLYMPUS公司产品，型号：IX51，呈像系统为Image－Pro Plus AMS.

1.2 仪器

测序由博尚公司完成，PCR仪购自PERKIN ELMER公司，NANO Drop 1000购自Thermo公司，摇床购自Forma Scientific公司，由分光光度仪购自Pharmacia Biotech公司，水浴锅为精宏公司产品，常温离心机为Thermo公司产品，4℃离心机购自eppendorf公司，4℃高速大型离心机购自HITACH公司，超声破胞仪购自宁波科生仪器厂，KARMA NiSepharose 6FF购自业力生物，Envision购自Perkin Elemer公司，机器加样器为Beckman公司出品.

1.3 重组基因的构建

1.3.1 目的基因的扩增

以质粒IRE1 alpha－pcDNA3.EGFP为模板，上游引物：AATTGAATTCCCATGATCACCTATCCCCTGAGCATGCA；下游引物：TATCTCGAGTCAATGATGATGATGATGATGGAGGGCGTCTGGAGTCACTGG；在上下游引物分别引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切切点，同时在下游引物中引入了6×His标签.引物由上海生工生物工程公司合成.PCR反应参数为95℃预变性5 min，95℃变性45 s，56℃变性30 s，72℃延伸2 min，35个循环，72℃延伸5 min.

PCR扩增模板的1 384位到2 931位［11］，经1%的琼脂糖凝胶检测.

1.3.2 目的基因的酶切、连接、转化以及克隆鉴定

参照Invitrogen公司网站提供的Bac－to－bac TOPO Expression System说明书，将目的基因经特异性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后连接到pFAST－Bac1质粒载体上，测序无误后，将质粒转化DH5α菌株，抽提出IRE1－pFAST－Bac1重组质粒，转化到DH10BacTM菌株中，在含有通过庆大霉素、卡那霉素、四环素、X－gal和IPTG的平板上培养，经蓝白斑筛选挑出白斑，提取质粒，引入M13引物通过PCR方法分析产物的长度来检验目的片段是否成功插入［12］.PCR反应参数为95℃预变性5 min，95℃变性45 s，56℃变性30 s，72℃延伸2.5 min，35个循环，72℃延伸5 min.

1.4 昆虫细胞的培养

在昆虫细胞培养基Sf－900Ⅱ中加入青霉素50 kU／L、链霉素50 mg／L以及10%的胎牛血清，在无CO2的细胞培养箱中培养Sf9细胞，培养细胞三代至稳定，才可用于杆状病毒复制.

在昆虫细胞培养基GIBCO GRACE中加入青霉素50 kU／L、链霉素50 mg／L、2.5%的胎牛血清和18 mmol／L的Glutamin，在无CO2的细胞培养箱中培养Hi－5细胞，培养细胞3代至稳定，才可用于杆状病毒侵染和重组蛋白的表达.

1.5 重组杆粒DNA转染Sf9细胞、重组杆状病毒的包装和获得以及重组杆状病毒侵染Hi－5细胞

当Sf9细胞长至密度约80%且生长状态良好时，按照CellFectin（Invitrogen）转染试剂的说明书，将重组的杆粒DNA转染到Sf9细胞中.3 d后观察到Sf9细胞核内容物变多，核变大，核折光性增强、细胞贴壁不牢等现象时，将细胞吹打下来，并转移至离心管中，800 r／min×3 min离心，收取上清为第一代重组杆状病毒，用于进一步感染Sf9细胞并扩增病毒.

当Hi－5细胞在直径为20 cm的培养皿中长至密度大于80%时，将扩增的病毒感染Hi－5细胞，当Hi－5细胞出现核变大，贴壁不牢并成团漂浮起来等现象时，将细胞吹打下来，转移到30 mL离菌管中，4℃离心，6 000 r／min×5 min，收集细胞.

1.6 目的蛋白hIRE1α（462 aa—977 aa）［11］的表达纯化

hIRE1α胞内段含有激酶以及核酸酶结构域，选取462位至977位的氨基酸，包含了激酶、核酸酶结构域以及一部分跨膜区段.

上一步收集的细胞用4℃预冷的裂解缓冲液（25 mmol／LTris－HCl pH7.5，50 mmol／L KCl，5 mmol／L MgCl2，1 mmol／L EDTA，10% 甘油，1%Triton－X100，1 mmol／Lβ－巯基乙醇）重悬；后置于冰上，超声裂解（超声1 s，间隔1 s，强度45%，时间120 s，超声裂解至镜下观察无明显的团状细胞）；4℃，12 000 r／min×15 min，离心至管壁上没有白色物质沉积，收集上清.

取1 mL Ni－beads，4℃，1 000 r／min×1 min离心，弃去上清，用平衡缓冲液（25 mmol／L Tris－HCl pH7.5，50 mmol／L KCl，5 mmol／L MgCl2，1 mmol／L EDTA，10% 甘油，1 mmol／Lβ－巯基乙醇）重悬beads，4℃，1 000 r／min×1 min离心，弃去上清；取裂解步骤中收集到的上清，与平衡过的beads混合，4℃摇晃轻柔孵育2 h.

孵育后的的上清倒于5 mL管柱，穿透（flowthrough）流出，beads连同结合的蛋白沉在管柱底部.用5 mL含0mmol／L 咪唑的缓冲液（25 mmol／L Tris－HCl pH7.5，50 mmol／L KCl，5 mmol／L MgCl2，1 mmol／L EDTA，10% 甘油）缓慢润洗beads，后用含50 mmol／L咪唑的除杂缓冲液（25 mmol／L Tris－HCl pH7.5，50 mmol／L KCl，5 mmol／L MgCl2，1 mmol／L EDTA，10% 甘油，1 mmol／Lβ－巯基乙醇，50 mmol／L 咪唑）缓慢润洗beads，不断吸取20μL流出的液体滴入预先准备好的180μL G250中，至G250不显示蓝色，则认为杂蛋白清除干净.

杂蛋白清除干净后，每次用500μL含250 mmol／L咪唑的洗脱缓冲液（25 mmol／L Tris－HCl pH7.5，50 mmol／L KCl，5 mmol／L MgCl2，1 mmol／L EDTA，10% 甘 油，1 mmol／Lβ－巯基乙醇，250 mmol／L咪唑）洗脱目的蛋白，间断吸取20μL流出的蛋白液体滴入预先准备好的180μL G250中，至G250不显示蓝色，则认为目的蛋白已洗脱尽.

预先准备好脱盐缓冲液（25 mmol／L Tris－HCl pH7.5，50 mmol／L KCl，5 mmol／L MgCl2，1 mmol／L EDTA，10% 甘油，1 mmol／Lβ－巯基乙醇）置于4℃预冷，蛋白置于脱盐缓冲液中，4℃轻柔旋转过夜以达到去除咪唑的目的.透析脱盐后的蛋白，测定浓度之后，分装并冻存于－80℃.

上清、沉淀、目的蛋白、Flowthrough、杂蛋白以及目的蛋白与2×loading buffer等体积混合，100℃煮样10 min，用以聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）检测.

1.7 目的蛋白活性的检测

采用HTRF（Homogeneous Time－resolved Fluorescence）激酶测活方法.在 HTRF试剂盒中，S2是一段含有磷酸化位点的肽段，可被IRE1激酶识别并磷酸化.参照试剂盒推荐的反应时间，底物与蛋白30℃孵育1 h，加入抗体和染料，30℃孵育1 h后，荧光检测仪Envision在405 nm的激发波长下，检测620 nm和665 nm的两个发射波长下产物的荧光信号，并通过两个发射波长下荧光信号的比值来判定酶活性的强弱.同时设置空白对照来判定酶活性的有无以及强弱.

1.8 IRE1激酶抑制剂高通量筛选体系的建立

1.8.1 酶、底物以及DMSO浓度的确定

依照激酶测活HTRF法，底物S2浓度暂定为800 nmol／L，ATP暂定为50μmol／L，酶自最高浓度逐步稀释，同时设置酶的空白对照.根据荧光读值，绘制酶促反应曲线，综合考虑酶和空白对照的窗口值以及反应速度的线性范围，来确定酶促反应的合适酶浓度.

众所周知，Km即是酶促反应达到最大反应速度一半时的底物浓度.因为本文的反应是S2与ATP双底物，故测定一个底物的Km值时，需先使另一种底物过量，然后做出相应底物的不同浓度对应的反应速度（即HTRF signal），通过回归计算，最终获得最大反应速度一半时的底物浓度，即Km值.

在上述酶与底物合适的浓度下，检测DMSO浓度对于酶活性的影响.

1.8.2 高通量筛选体系的评价

在白色384圆孔板中评价筛选体系是否符合高通量筛选的要求.阴性对照为之前一步确定的各种组分，阳性对照是在阴性对照的组分中加入100 nmol／L的星型孢菌素（STS，staurosporine，广谱的激酶抑制剂）.阳性、阴性对照各占板面积的1／2.

Z′因子是被广泛用于评价高通量筛选体系是否合格的的参数指标，用来评估反应体系的准确性和稳定性的［13］.根据公式：Z′因子＝1－3（SDneg＋SDpos）／（Mneg－Mpos），其中SDneg和Mneg分别代表阴性对照相对荧光强度的标准差和平均值；SDpos和Mpos分别代表阴性对照相对荧光强度的标准差和平均值.

CV（变异系数，coefficient of variation），是标准偏差与平均值之比，用百分数表示，即CV＝SD／mean×100%，用以衡量筛选体系的相对偏差.

1.8.3 广谱的激酶抑制剂星型孢菌素在高通量筛选模型上的评价

星型孢菌素（STS）是ATP竞争性抑制剂，广泛抑制激酶的活性，在确定的高通量筛选酶促反应体系中评价STS是否有抑制作用.

2 结 果

2.1 目的基因的扩增以及IRE1－pFAST－Bac1重组质粒的制备

从IRE1 alpha－pcDNA3.EGFP质粒中扩增目基因.hIRE1α（nt 1384—nt 2931）共有1 548个碱基，加上前后引物共有1 638个碱基.对比marker，PCR扩增如出现大小接近，且单一浓密的条带即证明扩增成功（见图1）.

图1 人源IRE1α（nt 1384—nt 2931）基因片段扩增琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果Fig.1 Results of PCR fragment of hIRE1α（nt 1384—nt 2931）detected by agarose electrophoresis

上一步扩增出的目的基因经酶切、连接、转化后，挑单克隆，抽取质粒，重组质粒IRE1－pFAST－Bac1经双向测序无误后，转化到DH10BacTM菌株中，经蓝白斑筛选挑出白斑，提取质粒，采用引物M13，进行PCR扩增，若目的基因成功插入则能扩增出大小小约2 100 bp的条带，包含约1 600 bp的目的基因和约500 bp的载体片段；反之，则未能得到重组杆粒.结果显示，约2 100 bp处有清晰的条带，说明重组杆粒（命名为BacMid－IRE1）成功制备（见图2）.

图2 BacMid－IRE1质粒琼脂糖凝胶电泳鉴定结果Fig.2 Results of BacMid－IRE1 detected by agarose electrophoresis

2.2 重组杆粒对Sf9和hi－5细胞的感染

未经重组杆粒感染的对照组Sf9细胞贴壁牢固（见图3A），而感染了重组杆状病毒的Sf9细胞，当细胞直径增加，核变大，核内容物变多，细胞贴壁不牢时（见图3B），离心收取病毒用以后续病毒侵染.图中标尺长度代表50μm.

重组的杆状病毒进一步侵染Hi－5细胞，与未经重组杆状病毒侵染的对照组相比（见图4A），当细胞直径增大，细胞核内容物明显变多变杂，细胞也有明显的脱落时（见图4B），离心收取细胞用于表达纯化.图中标尺长度代表100μm.

图3 正常状态下的Sf9细胞（A）和受重组杆状病毒侵染72 h之后的Sf9细胞（B）Fig.3 Uninfected Sf9（A）cells and Sf9 cells infected with recombinant baculovirus（B）

2.3 目的蛋白hIRE1α（462aa—977aa）的获得

将经过Ni－Beads纯化的hIRE1α（462 aa—977aa）经过SDS－PAGE检测，结果显示：SDS－PAGE胶图经过考马斯亮蓝染色之后，55 kD出呈现清晰且单一的条带，大小与预期（56 kD）相符，表明hIRE1α（462 aa—977aa）在昆虫细胞中获得正确的表达（见图5）.因为有柱体积的残留，图5中lane 6为除杂后用250 nmol／L咪唑第一次洗脱下的蛋白，可见杂蛋白并未完全除净，lane 7—8为250 nmol／L咪唑后续洗脱下的蛋白，可见杂蛋白已基本除净.

图4 正常状态下的Hi－5细胞（A）和受重组杆状病毒侵染72 h之后的Hi－5细胞（B）Fig.4 Uninfected Hi－5（A）cells and Hi－5 cells infected with recombinant baculovirus（B）

图5 SDS－PAGE分析纯化的hIRE1α蛋白（462aa—977aa）Fig.5 The purified hIRE1αprotein（462aa—977aa）analyzed by SDS－PAGE

纯化的hIRE1α经测定，浓度测定为125μg／mL（约为2μmol／L）；SDS－PAGE结果经凝胶薄层扫描鉴定纯化的hIRE1α蛋白纯度约为85%.

2.4 IRE1激酶抑制剂高通量筛选体系的确定

底物S2浓度暂定为800 nmol／L，ATP暂定为50μmol／L，酶自最高浓度逐步稀释，同时设置酶的空白对照，选取酶促反应在线性范围内且窗口合适的酶浓度，根据酶活性曲线，选取了25 nmol／L作为合适的酶浓度.与空白对照相比，窗口值约为15倍（见图6）.

确定酶浓度为25 nmol／L，设定底物ATP浓度为200μmol／L使其在酶促反应中饱和，逐步稀释底物S2，通过回归计算，得出底物S2的Km值为300 nmol／L（见图7）.

确定底物S2的的浓度为300 nmol／L，选择其浓度为2μmol／L使其在酶促反应中饱和，逐步稀释底物ATP，通过回归计算，得出底物ATP的Km值为16μmol／L（见图8）.

图6 不同浓度的IRE1激酶活性Fig.6 Kinase activity of different concentrations of IRE1

图7 不同浓度的底物S2对IRE1激酶催化反应的影响Fig.7 Effect of concentrations of S2on the enzymatic reaction catalyzing by IRE1 kinase

图8 不同浓度的ATP对IRE1激酶催化反应的影响Fig.8 Effect of concentrations of ATP on the enzymatic reaction catalyzing by IRE1 kinase

过高的DMSO会对IRE1激酶活性产生影响，考察了4%、2%、1%和0%4个DMSO浓度（见图9），发现4%的DMSO浓度已经对IRE1激酶活性产生了20%的抑制；此外化合物溶解在DMSO中，随着DMSO浓度的降低，化合物的溶解性也会降低.综合两方面的因素，选择2%DMSO作为筛选条件.

2.5 高通量筛选模型的检测和阳性抑制剂的评价

用Z′因子和CV值来检测高通量筛选模型是否合格.一般认为，当Z′因子的值大于0.5且CV值小于10%时，才能高通量进行筛选.本模型Z′因子等于0.58，CV值等于7.5%，故认为本优化条件符合高通量筛选要求.

图9 不同浓度的DMSO对IRE1激酶催化反应的影响Fig.9 IRE1 kinase activity in different concentrations of DMSO

星型孢菌素是激酶的广谱性抑制剂，本文在本模型上检测了其对激酶的抑制作用，并且测得其IC50＝（13.83±3.9）nmol／L，与文献报道的（13±8.4）nmol／L相近［14］（见图10）.

图10 星型孢菌素抑制IRE1激酶活性的IC50＝（13.83±3.9）nmol／LFig.10 Concentration－dependent inhibition of IRE1 kinase activity by Staurosporine（IC50＝（13.83±3.9）nmol／L）

3 讨 论

体外分子水平实验模型常用于针对单靶点的药物发现，因其较容易进行高通量的筛选，近年来，分子筛选模型针对小分子抑调节剂剂的筛选被广泛用于新药发现.IRE1分子量较大，翻译后修饰较复杂，而昆虫表达系统具有真核表达系统的翻译后加工功能，如二硫键的形成、糖基化及磷酸化等，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白，更适用于高通量筛选，故选用昆虫表达系统进行蛋白表达.结合Bac－to－Bac杆状病毒系统，成功构建出杆状病毒的穿梭质粒并获得了高纯度的IRE1蛋白（见图3）.同时，相对于文献，引入His标签使得蛋白纯化更为简便快捷.

药物筛选是新药发现的最初阶段，高通量药物筛选具有速度快、效率高、成本低等诸多优点.实验中发现部分样品具有激活IRE1激酶的作用，将本筛选模型适当改进也可作为IRE1激酶激活剂的筛选模型进行使用.

HTRF（Homogeneous Time－resolved Fluorescence），结 合 了 荧 光 共 振 能 量 转 移（FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF，Time Resolved Fluorescence）是近年来公认并广泛用于检测蛋白分子激酶活性的一项成熟的技术［15］，HTRF技术以荧光信号取代了同位素信号，能较准确反映出激酶的活性.本研究采用HTRF技术测定IRE1激酶和化合物的相互作用，建立高通量的IRE1激酶抑制剂筛选模型，为相关的基础研究和新药发现奠定了坚实的基础.除了HTRF法之外，目前广泛使用的激酶测活方法还有 ADP－GLO［16］、Z′－LYTE［17］以及P32等方法.其中 ADP－GLO的测活原理是：激酶反应过程中消耗ATP产生ADP，激酶反应终止后，加入与酶促反应等体积的ADPGLO将反应产生的ADP转化为ATP，这些ATP被荧光素酶转化为光信号，信号强弱与激酶活性呈正相关.但是此方法也有不足之处：化合物有可能是抑制了荧光素酶的活性而使信号降低，这就很容易在筛选中造成假阳性.Z′－LYTE法也是基于荧光共振能量转移，可检测丝氨酸／苏氨酸、酪氨酸激酶的活性.当激酶反应发生时，标记了荧光共振基团的部分底物被磷酸化，而未被磷酸化的底物则被位点特异性的蛋白酶识别并且剪切，这种剪切破坏了荧光供体和荧光受体之间的能量转移，使其显示出较高的发射比（供体荧光基团激发后供体发射和受体发射的比率），未被剪切的底物荧光供体和受体之间保持很低的发射比.发射比在一定波长的激发光下被检测到，信号强弱与激酶活性呈反比.但其也有不足之处：在实验过程中需要设置0%和100%磷酸化率两个内参，并且线性范围小，这些因素为高通量筛选的质控带来不便.同位素P32测活方法是最经典的激酶测活方法，可以准确地反映出底物磷酸化的程度，并带来灵敏的信号窗口，但同位素很容易造成环境污染等一系列问题，且成本较高，实验操作也不便利.较之各种测活方法，HTRF因其灵敏度高、液体均相、操作简单、成本较低、对环境危害小等特点，故被选用.

作为IRE1激酶抑制剂的筛选模型，选用的实验条件既要照顾实验成本，又要是测定值足够大，并有较大的信号窗，并且需要保证药物的作用处于可检测的线性范围之内.本研究基于HTRF建立的IRE1激酶抑制剂高通量筛选模型使用Biomek FX自动化加样系统以保证实验的均一性以及准确性，在每块用于筛选的实验板上均设立空白和对照，检测每块板上的Z′因子和CV值，测定结果可信度高.

星型孢菌素是广谱的激酶抑制剂，据本模型测定该化合物对于IRE1激酶抑制作用的IC50为（13.83±3.9）nmol／L，与文献报道的（13±8.4）nmol／L相近，证明本实验方法较为可信，适宜进行高通量筛选.

IRE1激酶相关小分子调节剂的研究仅有零星报道，在大规模的药物筛选中未见到.随着更高密度微孔板、自动化液体处理系统、洗板机的联合使用，有望将本模型的筛选通量进一步提高，以满足当前对化合物筛选的更高要求.

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