β-酪啡肽-7对大鼠血糖及脂质过氧化的影响

韩东宁，王艳霞，徐晨阳，张源淑*，薛红霞

(南京农业大学 农业部动物生理生化重点开放实验室，江苏 南京 210095)

β-酪啡肽-7对大鼠血糖及脂质过氧化的影响

韩东宁，王艳霞，徐晨阳，张源淑*，薛红霞

(南京农业大学 农业部动物生理生化重点开放实验室，江苏 南京 210095)

目的：观察β-酪啡肽-7(β-casomorphin-7，β-CM-7)对糖尿病大鼠的降血糖作用并初步阐明其作用机制。方法：2月龄SD雄性大鼠40只，用链脲佐菌素(STZ)致大鼠糖尿病，造模成功后将大鼠分为4个组：空白对照组、糖尿病对照组、胰岛素治疗组(优泌林 3.7×10-8mol/(只·d))、实验组(β-CM-7 7.5×10-8mol/(只·d))。实验周期30d。测定血清中血糖含量、脂质过氧化物丙二醛(MDA)水平、超氧化物歧化酶(SOD)的活性、胰岛素和胰高血糖素的含量以及腿肌糖原、肝脏糖原的含量。结果：β-CM-7组与胰岛素治疗组大鼠血糖明显下降；同时血清中MDA水平降低，SOD活性升高，与糖尿病对照组相比，具有显著性差异(P＜0.05)；β-CM-7组胰岛素含量较糖尿病组有所增加，肌糖原含量较空白组显著升高(P＜0.05)。结论：β-CM-7具有减轻链脲佐菌素性糖尿病大鼠氧自由基损伤、促进胰岛素分泌、加速肌糖原的合成、降低血糖的作用。

β-酪啡肽-7；大鼠；血糖；脂质过氧化

乳中含有丰富的营养物质，生理功效较为全面，其基本成分除乳糖和乳脂外，主要为乳蛋白。近年来，人们对乳品化学及营养学的研究发现，牛乳蛋白含有许多具有潜在生物活性物质的前体，在相关酶的作用下可被降解成许多具有生物学功能的小肽。其中阿片活性肽又称为吗啡样活性肽，是研究较早也是较多的一类活性肽。

β-酪啡肽(β-casomorphins，β-CMs)是发现最早的一类具有阿片活性的乳源吗啡样活性肽，由β-酪蛋白经酶解产生，其前体的基本序列位于β-酪蛋白的第60～70氨基酸残基上，结构为NH2-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn-Ser-Leu-COOH。这一序列在多种动物的乳蛋白中具有保守性[1]，将其进一步水解可得到β-CM-9、β-CM-7、β-CM-6、β-CM-5、β-CM-4等同系物。以往研究发现[2-4]，β-CMs能在动物胃肠道被完整地吸收，产生与内源性阿片肽类似的生理调节功能，如提高外周胰岛素和胃泌素的分泌；调节胃肠运动，延长胃肠的排空时间和蠕动时间，促进肠道水分与电解质吸收；影响动物的行为、呼吸、睡眠等。米饭和牛奶同时食用可以降低血糖指标，对于防治糖尿病很有帮助[5]，但降糖作用的有效成分并不明确。宋晓丹等[6]的研究证实β-CM-7体外能够抑制小肠对葡萄糖的吸收，体内灌胃也具有辅助降血糖作用，但其作用具体机制不详。本实验以β-CM-7作用于链脲佐菌素(streptozotocin，STZ诱导的糖尿病大鼠，研究β-CM-7对高血糖大鼠血糖和脂质过氧化的影响，探讨其可能的降糖机制，为β-酪啡肽的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

SD大鼠，2月龄，雄性，购自浙江省实验动物中心，许可证号SCXF(浙)20080033；标准鼠粮、垫料 青龙山动物繁殖场。

链脲佐菌素(STZ) 美国Sigma公司；β-CM-7(序列：Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile，相对分子质量789.42，纯度95%，色谱纯) 美国凤凰药业有限公司；胰岛素注射液(优泌林：30%重组人胰岛素，70%精蛋白锌重组人胰岛素) 礼来苏州制药有限公司；葡萄糖测定试剂盒、丙二醛(MDA)测试盒、超氧化物歧化酶(SOD)测试盒、肌糖原及肝糖原测定试剂盒 南京建成生物工程研究所；胰岛素及胰高血糖素放射免疫分析药盒 北京北方生物技术研究所。

1.2 仪器与设备

怡成血糖仪及怡成虹吸式血糖试纸 北京怡成生物电子有限公司；SCR20BC高速低温离心机 日本日立公司；FMJ-182放射免疫γ-计数器 上海原子核研究所日环仪器一厂；WH-3微型旋涡混合仪 上海沪西分析仪器厂；BS210S电子分析天平 北京赛多利斯天平有限公司；SHA-C型恒温振荡器 常州国华电器有限公司；UV-2100型分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司。

1.3 链脲佐菌素性糖尿病大鼠模型的建立与分组

雄性SD大鼠40只，体质量150～180g。1周适应期后，随机留取6只作为正常对照组，其余为模型对照组。模型对照组大鼠禁食不禁水12h后以60mg/kg(以体质量计)一次性腹腔注射STZ溶液。正常对照组(简称空白组)注射等体积柠檬酸缓冲液。实验采用葡萄糖氧化酶法尾静脉采血，分别在24 、72h后测所有大鼠的空腹血糖水平，以空腹条件下两次血糖值均≥11.1mmol/L的判定为糖尿病大鼠。

在随机选取的34只大鼠中，有22只符合模型条件，造模成功率为64.7%，可以进行下一步实验。

将造模成功大鼠随机选8只作为糖尿病组，7只胰岛素组，7只为β-CM-7组。胰岛素组每天皮下注射胰岛素6U/只(3.7×10-8mol/(只·d))，β-CM-7组每天腹腔注射β-CM-7溶液7.5×10-8mol/(只·d)，空白组和糖尿病组每天腹腔注射等体积生理盐水。实验周期为30d，期间标准鼠粮与饮水不受限制，记录每天的饮水与采食量；每天称体质量一次，每5d测空腹血糖一次，实验末所有大鼠颈静脉采血后断颈处死，取血清、心、肝及腿肌等置于－80℃冰箱内冷藏备用。

1.4 生化指标测定

1.4.1 血清中葡萄糖含量测定

采用葡萄糖氧化酶法，按葡萄糖试剂盒说明书操作。

1.4.2 肝脏糖原和腿肌糖原含量测定

按糖原试剂盒说明书操作。称取60mg左右右腿股内侧肌及肝脏，按照1:3(m/V)加碱液后沸水浴20min，流水冷却；用蒸馏水稀释成5%肌肉、1%肝脏的糖原检测液。吸取糖原检测液100μL加入2mL显色液，充分混匀后置沸水中煮5min，流水冷却，于620nm波长处测吸光度，其中腿肌糖原含量是以腿肌组织的质量计，肝脏糖原含量是以肝组织的质量计。

式中：A测定管为测定管吸光度；A标准管为标准管吸光度；c为标准管含量；20为样本测定前稀释倍数；100为样本测定前稀释倍数。

1.4.3 血清中MDA含量测定

采用TBA比色法；按MDA测定试剂盒说明书操作。在532nm波长处，1cm光径，蒸馏水调零，测定各管吸光度。

式中：A测定管为测定管吸光度；A测定空白管为测定空白管吸光度；A标准管为标准管吸光度；A标准空白管为标准空白管吸光度；c为标准品浓度；n为样品测试前稀释倍数。

1.4.4 血清中总SOD活性测定

采用黄嘌呤氧化酶法，按超氧化物歧化酶测试盒说明书操作。在550nm波长处，1cm光径，蒸馏水调零测定各管。

式中：A对照管为对照管吸光度；A测定管为测定管吸光度；n1为反应体系稀释倍数；n2为样品测试前稀释倍数。

1.5 胰岛素和胰高血糖素含量的测定

按试剂盒说明书操作进行。采用放射免疫γ-计数器读取各测定管放射性计数，利用线性内插计算方式计算读取标准曲线求得个测定管胰岛素、胰高血糖素含量。胰岛素含量结果以每毫升血清中所含胰岛素的μIU数计，胰高血糖素含量结果以每毫升血清中含胰高血糖素的皮克(pg)数计。

1.6 数据处理

采用SPSS16.0统计软件进行统计分析，差异显著性检验采用单因子方差分析(One way ANOVA)中的LSD法。所有数值以±sx－表示。

2 结果与分析

2.1 一般状况

在大鼠饲养期间，空白组大鼠精神状况良好、反应灵敏、被毛光滑；胰岛素组大鼠精神较好,活动频繁；糖尿病组大鼠精神萎靡，行动缓慢，皮毛枯燥易脱落，部分趾间有病变，尿量明显增加，窝内潮湿并且气味重；β-CM-7组皮肤较糖尿病组光滑，窝内比糖尿病组干燥。

2.2β-CM-7对糖尿病大鼠体质量的影响

图1 不同组间大鼠体质量的动态变化(±sx，n＝6)Fig.1 Kinetic change of body weights of the rats from each group(±sx，n＝ 6)

由图1可见，实验期间空白组与胰岛素组大鼠体质量增加明显；糖尿病组大鼠体质量减轻；β-CM-7组体质量变化介于空白组和糖尿病组之间。

2.3β-CM-7对糖尿病大鼠血糖的影响

由图2可见，空白组大鼠血糖平稳的维持在正常水平；胰岛素组大鼠血糖则比较平整地维持在较低水平，逐渐接近空白组；糖尿病组大鼠血糖明显升高，一直持续到实验结束；β-CM-7组大鼠血糖显著低于糖尿病组，但并未使血糖降至正常水平；表明β-CM-7有缓解血糖升高的作用。

图2 不同组间大鼠空腹血糖的动态变化(±sx，n＝6)Fig.2 Kinetic change of fasting serum glucose levels of the rats in each group (±sx，n＝ 6)

2.4 大鼠采食及饮水量变化

表1 不同组间大鼠的饮水、采食量变化(±sx，n＝6)Table 1 The change in water consumption and daily food intake of the rats from each group (±sx，n＝ 6)

表1 不同组间大鼠的饮水、采食量变化(±sx，n＝6)Table 1 The change in water consumption and daily food intake of the rats from each group (±sx，n＝ 6)

注：*.与空白组相比，差异显著(P＜0.05)；#.与糖尿病组相比，差异显著(P＜0.05)。下同。

组别 平均饮水量/mL 平均采食量/g空白组 34.88±2.23# 28.47±2.13#糖尿病组 143.19±9.35* 33.94±1.35*胰岛素组 115.33±8.88*# 37.82±1.79*β-CM-7组 131.41±8.55* 32.64±1.23

由图1、表1可见，空白组大鼠体质量升高，但采食及饮水均在较低水平；胰岛素组饮水量较糖尿病组显著下降(P＝0.019)；糖尿病组大鼠体质量减轻，采食量显著高于空白组(P＝0.029)饮水量极显著高于空白组(P＝0.000)，符合糖尿病“三高一低”的临床症状，模型制造理想。β-CM-7组体质量、采食及饮水情况均介于空白组与糖尿病组之间，表明β-CM-7在一定程度上缓解了糖尿病的发展。

2.5β-CM-7对糖尿病大鼠糖原的影响

表2 不同组间大鼠肝、腿肌糖原含量的变化(±sx，n＝6)Table 2 Effect of β-CM-7 on hepatic and muscular glycogen in diabetic rats (±sx，n＝ 6)

表2 不同组间大鼠肝、腿肌糖原含量的变化(±sx，n＝6)Table 2 Effect of β-CM-7 on hepatic and muscular glycogen in diabetic rats (±sx，n＝ 6)

组别 肝糖原含量/(mg/g) 腿肌糖原含量/(mg/g)空白组 4.376±0.304 0.736±0.053#糖尿病组 2.670±0.197 1.431±0.088*胰岛素组 16.444±1.196*# 1.113±0.071*#β-CM-7组 2.657±0.192 1.599±0.062*

由表2可见，在肝糖原的合成上空白组、糖尿病组及β-CM-7组之间没有明显差异，胰岛素可以显著提高肝糖原的合成量；在肌糖原合成方面，糖尿病组、胰岛素组及β-CM-7组均显著高于空白组，β-CM-7组肌糖原含量最高，提示β-CM-7具有促进肌糖原合成的作用。

2.6 大鼠血清MDA水平和SOD活性变化

表3 各组大鼠MDA含量和SOD活性变化(±sx，n＝6)Table 3 Effect of β-CM-7 on MDA level and SOD activity in serum of diabetic rats (±sx，n＝ 6)

表3 各组大鼠MDA含量和SOD活性变化(±sx，n＝6)Table 3 Effect of β-CM-7 on MDA level and SOD activity in serum of diabetic rats (±sx，n＝ 6)

组别 MDA含量/(nmol/mL) SOD活性/(U/mL)空白组 6.72±0.21# 131.43±5.50#糖尿病组 11.56±2.87* 83.43±16.89*胰岛素组 7.61±0.42# 134.88±9.85#β-CM-7组 6.13±0.28# 131.52±10.82#

由表3可见，空白组大鼠MDA水平较低，同时SOD活性较高；糖尿病组大鼠血清中MDA含量显著高于其他各组；并且血清中SOD的活性也显著低于其他各组，表明该组大鼠处于严重脂质过氧化状态，使机体受到损伤。β-CM-7组MDA含量及SOD活性均接近空白组，表明β-CM-7具有明显提高机体SOD活性，清除氧自由基，抑制脂质过氧化的作用，从而保护机体免受伤害。胰岛素也具有与β-CM-7类似的提高机体抗氧化能力的功效。

2.7 大鼠血清胰岛素和胰高血糖素含量变化

表4 各组大鼠胰岛素和胰高血糖素含量变化(±sx，n＝6)Table 4 Effect of β-CM-7 on serum insulin and glucagon in diabetic rats (±sx，n＝ 6)

表4 各组大鼠胰岛素和胰高血糖素含量变化(±sx，n＝6)Table 4 Effect of β-CM-7 on serum insulin and glucagon in diabetic rats (±sx，n＝ 6)

组别 胰岛素含量/(μIU/mL) 胰高血糖素含量/(pg/mL)空白组 56.65±3.40# 213.04±16.02糖尿病组 44.82±1.46* 269.98±13.52胰岛素组 89.62±5.51*# 303.53±20.60*β-CM-7组 54.57±2.00 345.97±32.09*#

由表4可见，胰岛素组胰岛素含量最高，显著高于其他各组；空白组、β-CM-7组及糖尿病组大鼠胰岛素含量依次降低。在胰高血糖素含量上，β-CM-7组含量最高，显著高于空白组与糖尿病组；胰岛素组、糖尿病组与空白组中胰高血糖素含量依次下降。

3 讨论与结论

大鼠糖尿病模型的制备多采用STZ诱导，其对动物的胰岛β细胞具有高度选择性毒性作用[7]。较大剂量腹腔注射STZ可破坏胰岛细胞导致胰岛功能衰竭, 血糖明显升高，可明显表现出典型1型糖尿病症状。在实验周期30d内，糖尿病组因血糖过高及营养代谢紊乱死亡2只，胰岛素注射初期死亡1只。糖尿病组大鼠出现脱毛、多饮、多尿、多食、尿味加重并伴有体质量持续下降，趾间有病变等糖尿病症状，表明本研究采用STZ诱导糖尿病大鼠模型可行可靠，效果理想。

酪蛋白是乳中最重要的蛋白成分，含有人体必需的8种氨基酸，是一种全价蛋白质[8]，经蛋白酶分解产生的肽段所具有的潜在生物学活性已受到广泛重视。酪啡肽是一种最具有代表性的小分子多肽，其中β-CM-7是由酪蛋白酶解所产生的乳源活性肽中重要成员之一，其结构为Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile。有研究证实[9]，β-CM-7对狗的食后胰岛素和生长抑素有明显的外周调控作用；体外研究表明β-CM-7对小肠囊葡萄糖的吸收有一定抑制作用。这些结果提示β-CM-7对糖的代谢可能要一定的调节作用[10]。本实验在大鼠体内证实β-CM-7具有促进胰岛素分泌、促进肌糖原合成缓解血糖升高的作用，结果与Zong Yafeng[11]、宋晓丹[12]、Yin Hong[13]等一致。

体内氧自由基能攻击生物膜中多聚不饱和脂肪酸，可引起一系列有害的氧化反应，称为脂质过氧化(lipid peroxidation，LPO)[14]。由此产生一系列脂质过氧化物。MDA是由自由基引发的脂质过氧化作用的最终产物，其含量可间接反映机体的LPO水平。在清除自由基的过程中，抗氧化酶起着重要的作用。抗氧化酶主要有SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等。SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，能清除超氧阴离子自由基，保护细胞及机体免受伤害。

持续高血糖是引起糖尿病并发症产生的主要原因。持续的高血糖状态可在体内产生大量氧自由基，使体内自由基防御机制受损，两者共同导致氧化应激的加剧[15]，引起组织细胞的过氧化损伤，使靶器官遭到伤害进而导致并发症的发生[16]。糖尿病的发病与自由基的损伤有密切关系，提示人们采用抗氧化剂治疗糖尿病的可能性[17]。本实验结果显示，糖尿病大鼠体内脂质MDA含量显著增高，SOD活性显著下降，提示大鼠体内脂质过氧化程度显著增强。β-CM-7可明显提高机体SOD活性，清除自由基抑制脂质过氧化作用，说明β-CM-7可减轻自由基及其代谢产物对各组织的伤害作用，提示β-CM-7对防治糖尿病及其并发症方面可以起到重要作用。

本结果显示β-CM-7对链脲佐菌素性糖尿病大鼠具有降血糖功效。提示牛奶及乳制品降解产生的β-CM-7具有降血糖作用，其降血糖作用与其具有促进肌糖原合成加速清除氧自由基、抗脂质过氧化有关。

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Effect ofβ-Casomorphin-7 on Blood Glucose Level and Its Anti-lipid Peroxidation Effect in Diabetic Rats

HAN Dong-ning，WANG Yan-xia，XU Chen-yang，ZHANG Yuan-shu*，XUE Hong-xia
(Key Laboratory of Animal Physiology and Biochemistry, Ministry of Agriculture, Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095, China)

Objective: To explore the effect ofβ-casomorphin-7 (β-CM-7) on blood glucose and oxidative stress in diabetic rats induced by streptozotocin (STZ). Methods: Forty male SD rats were divided into 4 groups: normal group, diabetic control group, insulin treatment group (administered with humulin at 3.7 × 10-8mol/(day animal)) andβ-CM-7 (7.5 × 10-8mol/(day animal)) treatment group. After administration for 30 consecutive days, all rats were sacrificed and measured for serum glucose level, MDA level, SOD activity and the contents of insulin and glucagons as well as leg muscle glycogen and liver glycogen contents. Results: Theβ-CM-7 treatment and insulin treatment groups revealed a significant decrease in blood glucose level, a reduction in MAD level, and an increase in SOD activity when compared with the diabetic control group (P＜0.05). Theβ-CM-7 treatment group displayed an increase in insulin content when compared with the diabetic control group and a significant increase(P＜0.05) in liver glycogen content when compared with the blank control group. Conclusion:β-CM-7 can reduce free radicalmediated oxidative stress and blood glucose level, promote the secretion of insulin and increase the content of muscular glycogen in diabetic rats thus having hypoglycemic effect.

β-casomorphin-7；rat；blood glucose；lipid peroxidation

R151.3

A

1002-6630(2012)05-0243-05

2011-04-07

国家自然科学基金项目(30871838)

韩东宁(1985—)，男，硕士研究生，研究方向为乳源生物活性肽。E-mail：2009107030@njau.edu.cn

*通信作者：张源淑(1962—)，女，教授，博士，研究方向为乳源生物活性物质的非营养性功能、肽的生物学。E-mail：zhangyuanshu@njau.edu.cn