响应曲面法优化酶解条件制备乳源ACE抑制肽

徐 鑫，蔡丽丽，刘国艳，何佳易，魏晓蕊，王之颖，张 军

(1.扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州 225127；2. 扬州大学实验农牧场，江苏 扬州 225001)

响应曲面法优化酶解条件制备乳源ACE抑制肽

徐 鑫1，蔡丽丽1，刘国艳1，何佳易1，魏晓蕊1，王之颖1，张 军2

(1.扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州 225127；2. 扬州大学实验农牧场，江苏 扬州 225001)

采用响应曲面法优化胰蛋白酶(PTN6.0S)酶解酪蛋白酸钠的工艺条件，制备高活性的血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽。利用准确度更高的RP-HPLC法测定酶解产物的ACE抑制率，通过单因素和响应面试验设计，分别考察pH值、温度、时间、底物质量浓度、酶与底物比等因素对ACE抑制肽活性的影响。结果显示：响应曲面法优化酶解条件得到数学模型为：抑制率/%＝－11.21347＋4.32902A－1.45953B＋3.42928C－0.20303D＋0.050303AB＋0.047422AD＋0.14955BC＋0.12486BD－0.054526A2－0.079754B2－0.53587C2－0.28096D2，确定最佳工艺条件为pH7.0、温度52.31℃、时间19.44h、底物质量浓度5.91g/100mL、酶与底物比8.37‰，此时ACE抑制率达97.11%。关键词：酪蛋白酸钠；胰蛋白酶；ACE抑制肽；响应曲面法；RP-HPLC

高血压已在世界范围内成为发病率最高的慢性疾病之一[1]，也是心血管疾病最主要的诱因[2]，严重危害人体健康。近年来，各国学者从不同食物蛋白酶解产物中相继发现具有血压调节功能的安全、无副作用的血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme，ACE)抑制肽[3-10]。酪蛋白酸钠是一种富含生物活性肽的蛋白质，其蛋白结构与酪蛋白相似且溶解性明显优于后者，它在特异性蛋白酶作用下能释放出诸如类阿片肽、免疫调节活性肽、ACE抑制肽等生物活性肽是酶解的优良底物[11-12]。此外，选择适宜的酶进行酶解能够使产物的生物活性最大化，胰蛋白酶专一性相对较高，在制备生物活性肽的同时又可以改善蛋白的消化作用，降低蛋白的致敏性[6]。

本实验选用酪蛋白酸钠为原料，经胰蛋白酶(PTN6.0S)酶解，采用RP-HPLC法测定酶解产物的ACE抑制率，通过单因素及响应曲面试验优化酶解条件，为ACE抑制肽的研究开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酪蛋白酸钠(蛋白含量87%) 新西兰恒天然公司；胰蛋白酶PTN6.0S(酶活力1.89×104U/g) 丹麦诺维信公司；马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)、血管紧张素转换酶(ACE)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、马尿酸(HA)美国Sigma公司；水、甲醇和三氟乙酸(TFA)均为HPLC级。

1.2 仪器与设备

524型恒温磁力搅拌器 上海梅颖浦公司； RV 10基本型旋转蒸发仪 德国IKA公司；5804R高速离心机 德国Eppendorf公司；Delta320pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；Alphal-2 LD Plus冷冻干燥机 德国Christ公司；LC-20AT高效液相色谱仪、SPD-20A UV/Vis紫外检测器 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 ACE抑制多肽样品制备工艺

酪蛋白酸钠→双蒸水溶解→加酶→恒温酶解→灭酶(沸水浴，10min)→离心(10000r/min，4℃，15min)→取上清液→旋转蒸发浓缩→冷冻干燥→冻干粉

1.3.2 酶解工艺条件的单因素试验设计

依据所用酶的最佳酶解条件以及前期实验的结果，设定固定酶解温度50℃、时间8h、底物质量浓度3g/100mL、pH7.0，酶与底物比1‰中的4个因素，改变其中1个因素，进行单因素试验，各因素梯度设计为：温度35、40、45、50、55、60、65℃；时间3、8、13、18、23、28、33h；底物质量浓度1、2、3、4、5、6、7g/100mL；酶与底物比0.1‰、0.2‰、0.4‰、1‰、2‰、4‰、10‰，pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。

1.3.3 酶解工艺条件的响应曲面试验设计

根据Box-Behnken设计原理，以酶解产物的ACE抑制率为响应值，选取温度、时间、底物质量浓度、酶与底物比为影响因素，进行四因素三水平分析，共29个试验点，其中5个为中心点，具体设计见表1。

表1 酶解工艺条件的响应曲面试验设计表Table 1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in response surface analysis

1.3.4 ACE抑制活性的测定

将HHL和ACE分别溶于pH8.3的HEPES缓冲液。取10μL的ACE溶液和50μL样品(0.05g/L)混合置于37℃水浴5min，然后于同一温度下加入80μL的HHL溶液水浴反应30min，最后在混合体系中加入200μL HCl(1mol/L)终止反应，样品经0.22μm的滤膜过滤后进样[13-18]。

色谱条件：Intertsil ODS-SP柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：体积分数50%甲醇，其中包含0.1% TFA，流速：1mL/min，检测波长：228nm；柱温：25℃；检测时间：20min；进样量：10μL；定量方法：外标法。抑制率用下式计算。

式中：Ec是ACE抑制剂不参加反应的条件下测得的吸光度(空白样品组)；Es是ACE及ACE抑制剂都存在条件下测得的吸光度(样品组)；Eb是ACE不参与反应的条件下的吸光度(底物HHL组)。

1.4 数据处理

响应曲面试验数据采用Design Expert 7.0软件绘图并作方差和显著性分析。

2 结果与分析

2.1 单因素酶解试验结果

2.1.1 酶解温度对ACE抑制率的影响

图1 酶解温度对ACE抑制活性的影响Fig.1 Effect of hydrolysis temperature on in vitro ACE inhibitory activity of sodium caseinate hydrolysate

由图1可知，50℃时ACE抑制率最高，偏离此温度抑制率会发生不同程度的降低，这与胰蛋白酶(PTN6.0S)的最适作用温度相符合。据此，在响应曲面试验设计中选择50℃为中心温度。

2.1.2 酶解时间对ACE抑制率的影响

如图2所示，ACE抑制率在0～8h内逐渐上升，8～18h内稳步下降，18～33h内下降速度加快。因此，确定8h为最佳酶解时间。据Mullally等[19]报道，在最初的酶解阶段，ACE抑制活性肽能够被逐步释放出来，但是进一步降解并不能使ACE抑制活性得到进一步的提升。长时间的酶解可能会使ACE抑制肽进一步降解，由此减弱了产物的ACE抑制活性。

图2 酶解时间对ACE抑制活性的影响Fig.2 Effect of hydrolysis time on in vitro ACE inhibitory activity of sodium caseinate hydrolysate

2.1.3 底物质量浓度对ACE抑制率的影响

图3 底物质量浓度对ACE抑制活性的影响Fig.3 Effect of substrate concentration on in vitro ACE inhibitory activity of sodium caseinate hydrolysate

如图3所示，底物质量浓度在1～4g/100mL范围内，ACE抑制率随着底物质量浓度的增加而上升，之后底物质量浓度增加，ACE抑制率逐渐降低。有报道显示与此相一致的趋势[20-22]，底物质量浓度的增加对酶有抑制作用，即多个底物分子可能占据了酶的部分活性位点，使酶不能发挥很好的效果。据此，在响应曲面试验设计中选择4g/100mL为中心底物质量浓度。

2.1.4 酶与底物比对ACE抑制率的影响

图4 酶与底物比对ACE抑制活性的影响Fig.4 Effect of ratio of enzyme to substrate on in vitro ACE inhibitory activity of sodium caseinate hydrolysate

如图4所示，酶与底物比也是影响酶解产物ACE抑制率的重要因素，随着酶量的增加，ACE抑制率上升，酶与底物比在0.1‰～4‰范围内，ACE抑制率上升趋势很明显。据此，考虑实验成本等因素，在响应曲面试验设计中选择5.5‰为中心酶与底物比。

2.1.5 pH值对ACE抑制率的影响

图5 pH值对ACE抑制活性的影响Fig.5 Effect of pH on in vitro ACE inhibitory activity of sodium caseinate hydrolysate

如图5所示，pH值对酶解产物的ACE抑制率影响较小，而在活性测定中pH值会对测定结果产生较大干扰。综合考虑后，在响应曲面设计中，固定pH值为7.0，不考虑pH值的变化对酶解产物ACE抑制率的影响。

2.1.6 RP-HPLC色谱图

图6 标准样马尿酸(HA)色谱图Fig.6 Chromatograms of hippuric acid standard

图7 空白样色谱图Fig.7 Chromatograms of control sample

由图6可知，马尿酸(HA)标样出峰时间在5.150min，图7所示的空白样品在相同保留时间也出峰，通过对HA峰面积的计算，可以精确计算出不同样品的ACE抑制率。

2.2 响应曲面法优化酶解条件结果

2.2.1 响应曲面试验结果

由表2可知，根据回归模型的显著性剔除了不显著交互项AC和CD，分析结果显示，模型的F值为15.89，P＜0.01，表明该回归模型显著。失拟项的P值为0.174，说明失拟不显著，该模型有较好的拟合度。根据回归系数，可得二次多项回归方程：抑制率/%＝－11.21347＋4.32902A－1.45953B＋3.42928C－0.20303D＋0.050303AB＋0.047422AD＋0.14955BC＋0.12486BD－0.054526A2－0.079754B2－0.53587C2－0.28096D2。回归系数的显著性分析结果表明，C项(P＝0.0004)、D、A2、B2、D2项均P＜0.01，均为显著项。

表2 响应曲面法优化酶解条件的试验设计与结果Table 2 Test design and results of hydrolysis condition optimization by response surface methods

2.2.2 响应曲面分析与条件优化

图8列出了各因素间交互作用的响应曲面图(CD、AC项不显著，被剔除)。由曲面的弯曲程度和等高线可以看出，图8a中，温度一定时，ACE抑制率随时间先上升后下降，不同温度条件下，ACE抑制率对时间的变化也呈现先上升后下降的趋势；图8b中，温度和酶与底物比对ACE抑制率的影响效果明显，均表现出先上升后下降的趋势；图8c中，底物质量浓度对ACE抑制率变化较小，总体较平缓，时间对其影响较明显；图8d显示，酶与底物比和时间对ACE抑制率的影响效果相近。

图8 酶与底物比、时间、温度、底物质量浓度交互影响ACE抑制率的响应曲面图和等高线图Fig.8 Response surface and contour plots showing the interactive effects of four hydrolysis parameters on ACE inhibitory activity of sodium caseinate hydrolysate

模型优化的最佳酶解条件为：温度52.31℃、时间19.44h、底物质量浓度5.91g/100mL、酶与底物比8.37‰，用胰蛋白酶在体系为pH7.0时酶解酪蛋白酸钠，多肽产物ACE抑制率为97.11%。

采用优化的条件对酶解酪蛋白酸钠进行重复性实验，为方便操作，条件设为温度52℃、时间19h、底物质量浓度6g/100mL、酶与底物比8‰、pH7.0，结果发现，该条件下得到多肽的ACE抑制率为96.5%，与模型估计值97.11%相比，相对误差为0.628%，说明采用响应曲面法优化得到的酶解工艺条件参数准确可靠，利用本实验建立的模型在实践中进行预测是可行的。

3 结 论

本实验结果显示，多肽的体外ACE抑制活性与酶解条件并非简单的线性关系，各因素间的交互作用明显。胰蛋白酶酶解酪蛋白酸钠制备ACE抑制肽的最优工艺为：pH7.0的体系下，温度52.31℃、时间19.44h、底物质量浓度5.91g/100mL、酶与底物比8.37‰。此时，获得的多肽ACE抑制率最高，达97.11%。验证实验表明优化出的最佳工艺具有较好的可重现性。

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Response Surface Methodology for Optimization of Hydrolysis Conditions for the Production of Milk-derived Angiotensin-I Converting Enzyme (ACE) Inhibitory Peptides

XU Xin1，CAI Li-li1，LIU Guo-yan1，HE Jia-yi1，WEI Xiao-rui1，WANG Zhi-ying1，ZHANG Jun2
(1. School of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China；
2. Farm of Experiment, Yangzhou University, Yangzhou 225001, China)

In our present study, response surface methodology was used to optimize process conditions for the hydrolysis of sodium caseinate by trypsin to prepare highly active angiotensin-I converting enzyme (ACE) inhibitory peptides. ACE inhibitory rate was measured by RP-HPLC. One-factor-at-a-time method followed by response surface analysis was used to analyze the effects of pH, temperature, hydrolysis time, substrate concentration, enzyme/substrate ratio on ACE inhibitory activity of sodium caseinate hydrolysate. A mathematical model describing the relationship of ACE inhibitory activity of sodium caseinate hydrolysate with temperature (A), hydrolysis time (B), substrate concentration (C) and enzyme/substrate ratio (D) was obtained as follows:Y=－11.21347＋4.32902A－1.45953B＋3.42928C－0.20303D＋0.050303AB＋0.047422AD＋0.14955BC＋0.12486BD－ 0.054526A2－ 0.079754B2－ 0.53587C2－ 0.28096D2. The optimum hydrolysis conditions were determined as pH 7.0, 52.31 ℃, 19.44 h, substrate concentration of 5.91 g/100 mL and enzyme/substrate ratio of 8.37‰, resulting in an ACE inhibitory rate of 97.11%.

sodium caseinate；trypsin；ACE inhibiting peptides；response surface methodology；RP-HPLC

TS218

A

1002-6630(2012)05-0208-05

2011-04-28

江苏省高校自然科学基础研究项目(08KJD550004)；扬州市-扬州大学合作基金项目(YZ2008089)；江苏省科技型中小企业技术创新资金项目(BN2008207)；江苏省普通高校研究生科研创新计划项目(CXLX11_1017)

徐鑫(1977—)，男，副教授，博士，研究方向为功能性食品资源开发与利用。E-mail：xuxin@yzu.edu.cn