以豆粕为基质纳豆芽孢杆菌生长条件优化

张 强，王素英*

(天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134)

以豆粕为基质纳豆芽孢杆菌生长条件优化

张 强，王素英*

(天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134)

研究纳豆芽孢杆菌在以豆粕为基质的发酵培养基中的生长条件。利用全自动生长曲线测定仪，以菌液浊度OD660nm为指标，对纳豆芽孢杆菌液体发酵培养基中的氮源(豆粕)和碳源(葡萄糖)配比进行研究，确定豆粕质量浓度50g/L，葡萄糖质量浓度10g/L为最佳配比，并通过单因素及正交试验筛选出影响纳豆芽孢杆菌生长的主要条件。再根据Box-Behnken试验优化，结果表明，采用功率80W超声波处理豆粕4.32min，且培养基初始pH6.16，发酵温度35.5℃时纳豆芽孢杆菌在发酵生长13h后达到最大生物量，此时OD660nm为1.635。

纳豆芽孢杆菌；豆粕；正交试验；Box-Behnken试验

纳豆芽孢杆菌是一种从日本纳豆中分离出来的益生菌，是枯草芽孢杆菌的一个亚种[1]。研究显示，大豆蛋白水解物具有ACE抑制活性[2]，而豆粕中富含大量优质蛋白。利用纳豆芽孢杆菌发酵豆粕制备ACE抑制肽，主要是依靠菌种自身的复合酶系去水解蛋白[3-6]。然而菌种的生理代谢产物必定与其生长状况息息相关。为提高纳豆芽孢杆菌液体发酵生物量，本研究通过正交试验和Box-Behnken优化试验确定培养基的碳氮源最佳配比、培养基预处理和液体发酵的最优条件，旨在提高纳豆芽孢杆菌水解豆粕生成ACE抑制肽的产量。

1 材料与方法

1.1 菌种与培养基

纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)，由本实验室分离保存。

斜面培养基(g/L)：牛肉膏5、蛋白胨10、氯化钠5、葡萄糖20、琼脂粉15，pH7，水1L；种子培养基：配方同斜面培养基，但不加琼脂粉[7]。发酵培养基(g/L)：豆粕50、葡萄糖10、Na2HPO41、NaH2PO41、CaCl20.2、MgSO41，水 1L，pH7。

1.2 材料与仪器

豆粕(蛋白含量为48.74%的脱脂豆粕) 黑龙江广源粮油加工有限公司。

Bioscreen C全自动生长曲线测定仪 芬兰Bioscreen公司；ZD-88控温摇床培养箱 常州菲普仪器设备厂；YXQ-LS-30SII全自动数显高压灭菌锅 西安常仪仪器设备有限公司；AUW220D电子分析天平 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 种子液的制备

将斜面活化菌种制成浓度为108CFU/mL的菌悬液，并按体积分数2%接种量接种50mL于250mL三角瓶中，37℃、160r/min培养，每2h测1次菌液浊度(OD660nm)绘制生长曲线，对数生长期末18h培养物作为种子液进行发酵培养基优化[8-9]。

1.3.2 发酵培养基成分的优化

以豆粕作为氮源，设其质量浓度分别为10、20、30、40、50、60g/L，以葡萄糖作为碳源，设其质量浓度分别为10、20、30g/L，将不同质量浓度的氮源和碳源组合配成不同碳氮比(C/N比)的培养基，将培养基的初始pH值调节为7，于115℃灭菌20min后，取发酵培养基300μL，种子发酵液40μL点到Bioscreen C测定板上。设定37℃，振荡幅度Middle，自动测定36h，以纳豆芽孢杆菌菌液浊度为指标确定最佳配比[10-13]。

1.3.3 单因素和正交试验设计

单因素试验：利用Bioscreen C自动生长曲线测定仪，在同一多孔培养板上点样，设定温度30℃，振动强度为Middle，自动测定24h，以纳豆芽孢杆菌OD660nm值为指标，考察培养基初始pH值、超声功率[14]、超声时间、温度对纳豆芽孢杆菌生长的影响。

正交试验：为了反映各因素对纳豆芽孢杆菌生长的综合影响，在单因素试验基础上，以纳豆芽孢杆菌OD660nm值为指标，进行正交试验优化，因素及水平设计见表1。

表1 纳豆芽孢杆菌生长条件的正交试验因素水平设计表Table 1 Factors and levels for orthogonal array design

1.3.4 Box-Behnken试验设计

在正交试验结果基础上，选择显著因素，通过Box-Behnken试验设计进一步优化，以确定纳豆芽孢杆菌液体发酵数学模型和最优生长条件[15]。

1.3.5 数据处理

采用Excel和Minitab统计软件进行数据处理与分析，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。利用Origin8软件绘制数据图形。

2 结果与分析

2.1 发酵培养基最佳碳氮比的确定

图1 不同碳氮比对纳豆芽孢菌生长的影响Fig.1 Effects of ratio of carbon and nitrogen source on the growth of Bacillus subtilisnatto

以OD600nm值为指标，结果表明在葡萄糖质量浓度10g/L，豆粕质量浓度50g/L的发酵培养基中，纳豆芽孢杆菌的生长状况最佳，OD660nm值最大可达到1.4。在其他条件中，低质量浓度的葡萄糖和低质量浓度豆粕组合配制的培养基中纳豆菌的生长状况较好，且基本规律是葡萄糖质量浓度稍高时，豆粕质量浓度要相应降低，也就是说当碳源和氮源质量浓度同时过高时，不利于纳豆菌的生长。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 初始pH值的影响

图2 不同培养基初始pH值对纳豆芽孢杆菌生长的影响Fig.2 Effects of initial pH value on the growth of Bacillus subtilisnatto

在超声时间10min，功率50W，温度30℃的条件下，考察不同pH值对纳豆芽孢杆菌生长的影响，结果如图2所示。从生长曲线看，培养基初始pH值为6时，纳豆芽孢杆菌的生长最好，几乎不存在延滞期，且对数生长期很短，接种10h后菌悬液OD660nm值达到最大值1.2。

2.2.2 超声波功率的影响

在初始pH6，温度30℃的条件下，采用30、40、50、60、70、80、90、100W超声波功率对豆粕培养基进行破碎预处理，处理时间定为10min，工作1s间隔1s，之后进行纳豆芽孢杆菌的发酵培养，以观察超声波功率对纳豆芽孢杆菌生长的影响，结果见图3。

图3 超声功率对纳豆芽孢杆菌生长的影响Fig.3 Effects of ultrasonic power on the growth of Bacillus subtilisnatto

从图3可以看出，不同功率超声波处理豆粕培养基，均能促进纳豆芽孢杆菌的生长，并且随着功率的增加，纳豆芽孢杆菌的生长状况变好，功率达到80W时，菌悬液的OD660nm值最大，达到1.2，之后缓慢下降。可能是超声波处理导致豆粕蛋白结构变得松散，有利于纳豆芽孢杆菌利用。

2.2.3 超声波预处理时间的影响

对初始pH6的豆粕培养基进行超声波预处理，超声波预处理功率80W，将处理时间设置为3、5、7、10、15min，处理方式为工作1s间隔1s，之后在30℃条件下进行发酵培养，结果见图4。

图4 预处理时间对纳豆芽孢杆菌生长的影响Fig.4 Effects of ultrasonic treatment time on the growth of Bacillus subtilisnatto

由图4可知，与未进行预处理的豆粕培养基相比，3min和5min的短时间预处理，有利于纳豆芽孢杆菌的生长，处理7min时与未经处理的生长状况相当，10min和15min的长时间处理则不利于菌的生长，这可能由于短时间处理使得豆粕蛋白变性水解，促进纳豆芽孢杆菌的利用，而超声波处理时间过长，培养基产生大量气泡，对纳豆菌的生长有一定不利影响。

2.2.4 超声温度的影响

利用功率80W的超声装置对初始pH6的豆粕培养基进行超声处理3min，之后在Bioscreen C上进行纳豆芽孢杆菌最佳生长温度的选择。由图5可知，即使是很小幅度的温度变化，也会对纳豆芽孢杆菌的液体发酵生长造成较大的影响。在35℃时，该菌生长状况最佳，其最大OD660nm值是33℃时的1.4倍。在许多研究中认为纳豆芽孢杆菌最佳生长温度为37℃[16-17]，这一差异可能和Bioscreen C运行时的实际温度比设定温度略高有关。

图5 温度对纳豆芽孢杆菌生长的影响Fig.5 Effects of incubation temperature on the growth of Bacillus subtilisnatto

2.3 正交试验优化结果

表2 L9(34)正交试验结果Table 2 Orthogonal array design and results

从表2可以看出，各因素对纳豆芽孢杆菌生长的影响顺序依次为D＞C＞B＞A，即pH值＞温度＞处理时间＞功率，其中pH值、温度、预处理时间对纳豆芽孢杆菌生长的影响作用较预处理功率要大。从直观分析得出，纳豆芽孢杆菌在A1B2C1D1条件下生长状况最佳，经3次验证实验，该条件下平均OD660nm值为1.59。即最佳工艺条件为预处理功率为70W、处理时间5min、温度35℃、pH值为6.0。

2.4 Box-Behnken试验确定纳豆芽孢杆菌生长的最佳条件

为了进一步优化纳豆芽孢杆菌的生长条件，根据正交试验结果，选择影响较大的因素进行Box-Behnken试验设计(表3)，预处理功率设定为80W，利用Bioscreen C设定每0.5h自动测定1次OD660nm值，取最大值进行比较，结果见表4。

表3 Box-Behnken试验设计因素和水平表Table 3 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

表4 Box-Behnken试验优化结果Table 4 Box-Behnken experimental design and results

表5 方差分析表Table 5 ANOVA for the results from Box-Behnken experimental design

由表3、4可见，Box-Behnken试验结果得到回归方程：Y＝1.6333＋0.0088X1＋0.125X2＋0.0288X3－0.1142X12－0.1917X22－0.0442X32－0.175X1X2－0.015X1X3－0.0025X2X3。由表5可见，回归极其显著(P＜0.0001)，失拟并不显著(P＝0.1 3 2)，回归方程的确定系数R2=0.9976，表明该模型与实际情况非常拟合。理论上当发酵温度为35.50℃，pH6.16，预处理时间4.32min时，OD660nm达到最大值1.658。经过3次验证实验，取其平均值为1.635，与预测结果基本吻合。

3 结 论

3.1 以菌悬液OD660nm值为指标，优化了纳豆芽孢杆菌发酵培养基的碳氮比，即在基础无机盐成分中，葡萄糖质量浓度10g/L，豆粕质量浓度50g/L，即C/N比例为1:5时，菌悬液浓度达到最大。

3.2 采用单因素和正交试验，Box-Behnken试验优化，以菌悬液OD660nm值为指标，对豆粕超声波预处理功率和时间，培养基初始pH值及培养温度进行了优化，结果表明当利用功率80W的超声波预处理豆粕培养基4.32min，发酵培养条件为pH6.16，温度35.5℃时，纳豆芽孢杆菌生长情况最好，菌悬液OD660nm值达到1.635，比对照组(1.210)提高了35.12%。这与超声预处理破碎豆粕细胞，使得细胞内营养成分充分溶出益于纳豆菌利用有一定关系。此工艺优化对工业化扩大生产有指导意义。

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Optimization of Culture Conditions for the Growth ofBacillus subtilisnattoUtilizing Soybean Meal as Nitrogen Source

ZHANG Qiang，WANG Su-ying*
(Tianjin Key Laboratory of Food and Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Cell suspension turbidity (optical density at 660 nm, OD660 nm) was measured using an automated growth curve analyzer to investigate the growth ofBacillus subtilisnattoduring incubation in a liquid culture medium composed of soybean meal as nitrogen source and glucose as carbon source. The optimal concentrations of soybean meal and glucose were found to be 50 g/L and 10 g/L, respectively. Using one-factor-at-a-time combined with orthogonal array design method, temperature, pH and time were identify as major factors that influence the growth ofBacillus subtilisnatto. Further, Box-Behnken experimental design was used to optimize the main influencing factors.Bacillus subtilisnattoachieved the highest biomass after 13 h of incubation at initial pH 6.16 and 35.5 ℃ in the presence of soybean meal treated by ultrasonic for 4.32 min, and the cell suspension turbidity was 1.635 under these conditions.

Bacillus subtilisnatto；soybean meal；orthogonal array design；Box-Behnken experimental design

Q939

A

1002-6630(2012)05-0199-04

2011-05-12

天津市科技支撑计划重点项目(09ZCKFNC00800)

张强(1986—)，男，硕士研究生，研究方向为微生物资源与开发应用。E-mail：zq13920769130@163.com

*通信作者：王素英(1964—)，女，教授，博士，研究方向为微生物资源与开发应用。E-mail：wsying@tjcu.edu.cn