花果山“糯米茶”中黄酮化合物的分离纯化及活性研究

胡喜兰，姜 琴，尹福军，刘 涛

(淮海工学院化学工程学院，江苏 连云港 222005)

花果山“糯米茶”中黄酮化合物的分离纯化及活性研究

胡喜兰，姜 琴，尹福军，刘 涛

(淮海工学院化学工程学院，江苏 连云港 222005)

利用溶剂提取法对花果山“糯米茶”中的黄酮化合物进行提取，并利用硅胶柱色谱分离法对其进行分离纯化，同时通过DPPH抗氧化活性体外评价体系测定其清除自由基的能力。结果显示，“糯米茶”中的黄酮化合物具有一定的的清除DPPH自由基的能力，“糯米茶”是可开发的抗衰老、抗氧化的保健茶。

糯米茶；黄酮化合物；提取；活性

流苏，是连云港市云台山脉的特有树种，是珍贵的绿化树种，又是制作盆景的好材料。春天采其嫩叶，阴干，制成茶称为“糯米茶”。用其花制茶称为“糯米花茶”，清香爽口，别具一番风味，它们的药理作用多样，化学成分复杂，民间还常用糯米茶消积食，清内火，有明目之功能，茶渣可治胃病和小儿腹泻，具有药用价值[1]。目前国内对其有效成分的研究尚未见报道，所以研究和开发“糯米茶”的有效成分是很有必要的。本课题组选择连云港特有的“糯米茶”进行研究，测定了矿物元素、茶多酚、黄酮化合物和多糖的含量[2]，利用溶剂提取法对糯米茶中的黄酮化合物进行提取，并利用层析法对其进行分离纯化，同时通过DPPH自由基抗氧化活性体外评价体系测定其清除自由基的能力，为其综合应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

花果山“糯米茶”由江苏连云港康缘大药房吴舟中药师提供。用前将其置于烘箱中，55℃条件下干燥恒质量后粉碎，过40目筛，保存于磨口瓶中并置于干燥避光处，备用。

芦丁标准品 南京替斯艾么中药研究所；槲皮素、山奈酚标准品 中国药品生物制品鉴定所；异鼠李素标准品 美国 BioChemika公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美国Sigma Aldrich公司；VC、合成抗氧化剂叔丁基对苯二酚(TBHQ)、无水甲醇(色谱纯)、无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、无水甲醇、酒石酸钾钠、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等均为分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

WFZ-2000型紫外-可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司；DZF-6050真空干燥箱 鄄城华鲁仪器有限公司；RE52CS旋转蒸发仪 浙江舟山市定海区海源仪器厂；B-220恒温水浴锅 上海亚荣生化仪器厂；ZFI型四用紫外分析仪 上海顾村电光仪器厂；UV-2550紫外分光光度计、LC-10ADVP型高压液相色谱仪、CLASS-VP工作站、SPD-M10AVP二极阵列检测器 日本岛津公司；X-4显微熔点仪 上海精密仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黄酮化合物的提取

将“糯米茶”研磨、过40目筛，各取20g于20mL烧瓶中，加入约10倍的80%乙醇溶液于80℃水浴锅中进行溶剂提取1.5h，重复3次，将滤液进行减压抽滤，合并滤液。将所获得的滤液移入梨形瓶，进行浓缩。浓缩后的物质因黏于梨形瓶壁，所以使用馏分将其全部溶解转移入50mL烧杯，并将烧杯用保鲜膜封口，并戳几个小洞，使小瓶中的溶液挥干，而又不被污染，得粗提物，备用[3-4]。

1.3.2 黄酮化合物的分离、纯化

利用硅胶柱色谱分离[5-8]，采取湿法装柱，干法上样，然后依次用石油醚、乙酸乙酯、无水乙醇、50%的乙醇溶液对粗提物进行洗脱，至溶液基本无色，将所获得的洗脱液进行浓缩，浓缩后的物质因黏于瓶壁，所以使用馏分将其全部溶解转移至50mL烧杯中，用保鲜膜封口，并戳几个小洞眼，使瓶中的溶剂挥干，共收集得到A、B、C、D、E、F、G7个样品。

1.3.3 薄层色谱(TCL)检测

首先进行展开剂条件摸索，把上述样品用毛细管蘸取液体按一定顺序点在硅胶板上，放置层析缸跑板。而层析缸中依次为乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇(体积比8:2)、乙酸乙酯-甲醇(体积比6:4)、乙酸乙酯-甲醇(体积比2:8)、甲醇、甲醇-水(体积比8:2)、甲醇-水(体积比6:4)溶液量为10mL。一般约经30～40min，跑板结束，在紫外灯下清楚可见跑板情况，观察其是否有拖尾或含其他杂质等现象。

1.3.4 熔点测定

将样品进行重结晶，对析出的产品进行熔点测定，并与常见的黄酮化合物标准品，如芦丁(rutin)、槲皮素(quercetrin)、山奈酚(kaempferol)、异鼠李素(isorhamnetin)对比。

1.3.5 高效液相色谱检测

设置条件为：压力：0～40MPa；显示精度：±2%；流速：1mL/min；进样体积：20μL；操作温度：4～35℃；流动相：甲醇(色谱纯)；波长：360nm；取少量样品于小瓶内，将其溶剂挥干后，用适量甲醇溶解，待用[9]。

1.3.6 样品的抗氧化活性测定

采用DPPH自由基法测定。准确称取DPPH自由基，配制质量浓度为0.049mg/mL的DPPH自由基-乙醇溶液。以乙醇为溶剂，配制不同质量浓度的样品溶液，分别取0.1mL样品溶液，加入3.9mL质量浓度为2.5mg/100mL DPPH自由基-乙醇溶液，以乙醇替代样液为空白扫基线。将混合溶液摇匀，用比色皿，在515nm波长处测定其在不同时间的吸光度，根据下式计算DPPH自由基清除率[10-15]。

式中：AT为自由基清除过程中某一时刻DPPH自由基的吸光度；A0为以乙醇替代样品溶液的DPPH自由基的吸光度。

2 结果与分析

2.1 黄酮化合物的分离、纯化

石油醚洗脱过程中未发现洗脱液有颜色变化，仅在柱上端有黄色柱段出现，但一段时间没有位移，改换乙酸乙酯，有灰绿色物质洗出，用接收瓶A收集；洗脱液变浅发黄时，用接收瓶B收集；当柱内的有颜色部位基本没有位移时，换乙醇进行洗脱，用吸收瓶C收集；当有深绿色物质洗出时，用吸收瓶D收集；当洗脱液变浅时，用吸收瓶E收集；当有黄色物质洗出时，用吸收瓶F吸收；在柱内的有颜色部位基本没有位移时，用50%的乙醇溶液洗脱，由收集瓶G收集。A、C、D中溶剂挥干后基本没有产品，故对样品B、E、F、G进行薄层色谱检测。

2.2 TCL检测结果

图1 样品B、E、F、G在不同展开剂中的薄层色谱图Fig.1 TCL spectra of samples B, E, F and G in different mobile phases

由图1可知，甲醇的展开效果最好，即适用纯甲醇做展开剂最佳，故高效液相色谱选用甲醇作为流动相。硅胶柱色谱得到的样品B、E较多，有一定的研究价值，故与标准品芦丁(R)、槲皮素(Q)、山奈酚(K)、异鼠李素(I)进行TCL对比，为防止各样品发生拖尾现象，更好地分离区别开样品B和E，选用甲醇中加入甲酸作为展开剂，甲醇-甲酸(体积比9:1)10mL做进一步展开剂[6]，结果见图2。

图2 样品B、E、R、Q、K、I的薄层色谱图Fig.2 TCL spectra of samples B, E, R, K and I

由图2可知，样品E拖尾较长，可能不是纯化合物，还需进一步的纯化，样品B可能是芦丁(R)、槲皮素(Q)、山奈酚(K)、异鼠李素(I)中的一种，故对其熔点进行测定。

2.3 熔点测定结果

样品B在甲醇中结晶，析出浅黄色的粉末，其熔点为263～266℃，与几种标准品的熔点比较，相差较大，说明样品B不是上述几种标准品之一的产物。通过紫外谱图查证，结合熔点，初步判断B与7-羟基-4′-甲氧基异黄酮(C16H12O4)，熔点为263～264℃(甲醇中重结晶)，与芒柄花黄素有相似之处，但确认还需要对样品进行进一步的纯化分离，并利用相关质谱、氢谱、碳谱等进行表征，进一步的研究有待进行。

2.4 高效液相色谱检测结果

图3 粗提物(a)、样品B(b)、样品E(c)的高效液相色谱图Fig.3 HPLC spectra of crude extracts and samples B and E

由图3可知，粗提物在6min左右有两个明显的峰，且相互交融，经过柱色谱分离，从粗提物中分离出了两种黄酮化合物B和E，且通过峰面积计算，B的相对含量为99.72%，E的相对含量为99.54%。因样品B含量较样品E高，故下面选择样品B进行抗氧化活性测定。

2.5 清除 DPPH 自由基的能力

利用 DPPH的褪色效应，测定不同质量浓度的样品B在不同时间的吸光度，同时与0.56mg/mL VC及合成抗氧化剂TBHQ(0.55mg/mL)比较，计算不同质量浓度样品B溶液对DPPH自由基的清除率，结果见图4。

图4 不同质量浓度样品B对DPPH自由基的清除作用Fig.4 DPPH radical scavenging ability of VE, TBHQ and flavonoids from glutinous rice tea

由图4可知，在加入不同质量浓度样品B后，DPPH自由基的清除作用随着样品B质量浓度的增加而增大，且随着时间的推移，DPPH自由基的清除作用也在慢慢增加，其自由基的清除作用虽没有VC、TBHQ的强烈，但也具有一定的作用。

3 结 论

由于黄酮化合物酚羟基中的邻位酚羟基极易被氧化，且对活性氧等自由基有较强的捕捉能力，使黄酮化合物具有一定的抗氧化性和清除自由基的能力，而实验结果表明，“糯米茶”中含有的一定量的黄酮化合物，并具有一定的的清除 DPPH自由基的能力，说明“糯米茶”具有一定的体外抗氧化活性，可开发为抗衰老、抗氧化的保健茶。

[1] 吴舟. 云台山植物名录[M]. 北京: 植物文献社, 2001: 28.

[2] 胡喜兰, 姜琴, 尹福军, 等. 花果山 糯米茶,,和 糯米花茶,,中有效成分的提取与测定[J]. 食品科学, 2010, 31(18): 112-115.

[3] 胡喜兰, 韩照祥, 陶莹, 等. DPPH·法测定多种植物的抗氧化活性[J]. 食品科技, 2006, 180(10): 264-268.

[4] 张勇, 李彩霞, 李鹏, 等. 醇法提取锁阳中总黄酮的研究[J]. 甘肃科学学报, 2005, 17(7): 41-43.

[5] 马莺, 王静, 牛天娇. 功能性食品活性成分测定[M]. 北京: 化学工业出版社, 2005: 258-259.

[6] 卢艳花. 中药有效成分提取分离技术[M]. 北京: 化学工业出版社, 2005: 33-36.

[7] 黄文哲, 段金廒, 李正亮. 怀槐的化学成分研究Ⅰ[J]. 中国药科大学学报, 2000, 31(1): 8-10.

[8] 林启寿. 中草药成分化学[M]. 北京: 科学出版社, 1977: 343-344.

[9] 何丽一. 平面色谱方法及应用[M]. 北京: 化学工业出版社, 1999: 43-48.

[10] 郭亚力, 李聪, 欧灵澄, 等. 槐米中天然抗氧化剂的提取及其抗自由基性能研究[J]. 食品科学, 2004, 25(7): 154-157.

[11] 李红, 张元湖．应用DPPH·法测定苹果提取物的抗氧化能力[J].山东农业大学学报: 自然科学版, 2005, 36(1): 35-38.

[12] NEGI P S, JAYAPRAKASHA G K, JENA B S. Antioxidant and antimutageni activities of pomegranate[J]. Food Chemisty, 2003, 80: 393-397.

[13] 黄海兰, 王国明, 李增新, 等. 鸭跖草抗氧化成分提取及其活性研究[J]. 食品科学, 2008, 29(9): 55-58.

[14] 柳建军, 许立松, 王菁菁, 等. 黄连木嫩叶抗氧化活性研究[J]. 食品科学, 2008, 29(9): 45-47.

[15] 胡喜兰, 尹福军, 程青芳, 等. 不同花期芍药花中活性成分的研究[J].食品科学, 2008, 29(9): 511-514.

Extraction and Activity of Flavonoids from Glutinous Rice Tea Grown in Huaguo Mountain

HU Xi-lan，JIANG Qin，YIN Fu-jun，LIU Tao
(College of Chemical Engineering, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China)

Flavonoids were extracted from glutinous rice tea grown in Huaguo Mountain by solvent extraction and isolated by column chromatography on silica gel. The antioxidant activityin vitrowas determined by DPPH free radical scavenging assay. The results indicated that flavonoids from glutinous rice tea had certain free radical scavenging ability. In conclusion, glutinous rice tea has the potential to be developed as an anti-aging and antioxidant health-care tea.

glutinous rice tea；flavonoids；extraction；activity

R284

A

1002-6630(2012)05-0106-03

2011-09-26

连云港市自然科学基金项目(CG0806)；淮海工学院引进人才启动基金项目(KK01060)

胡喜兰(1961—)，女，教授，学士，研究方向为配位化学和天然药物化学的提取及应用。E-mail：huxilan@hhit.edu.cn