鲤鱼鱼肉蛋白酶水解物抗氧化性及功能特性

刘 骞，施 雪，孔保华*

(东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

鲤鱼鱼肉蛋白酶水解物抗氧化性及功能特性

刘 骞，施 雪，孔保华*

(东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

采用碱性蛋白酶对鲤鱼鱼肉蛋白进行酶解，制备不同水解度的水解物。测定水解物的抗氧化活性以及不同pH值条件下水解物的功能特性。结果表明：随着水解度的逐渐升高，水解物的抑制脂质氧化能力、DPPH自由基清除能力、还原能力以及金属离子(Cu2+和Fe2+)螯合能力逐渐增加(P＜0.05)；同时，水解物的溶解性、乳化性和起泡性都在pH值为4.0(等电点)时达到最低，而后溶解性和乳化性随着pH值升高而增大(P＜0.05)，而起泡性随着pH值的升高先上升后又下降。因此，鲤鱼鱼肉蛋白碱性蛋白酶水解物可以提高蛋白质的抗氧化活性和溶解性，但是较高的水解度会在一定程度上降低其乳化性和起泡性。

鲤鱼鱼肉蛋白；水解物；抗氧化性；功能特性

鲤鱼(Cyprinus carpio)是我国养殖量最大的一种淡水鱼，是非常重要的淡水鱼资源。鲤鱼的蛋白质不但含量高，而且质量也佳，人体消化吸收率可达96%，是主要的动物蛋白质来源之一。蛋白质的水解作用是简单并且价廉的把蛋白质转变成游离氨基酸和短链多肽的方法。近年来的研究表明，以数个氨基酸结合而成的低肽有比氨基酸更好的消化吸收性能，且营养和生理效果更为优越，它不仅具有易消化、易吸收的营养功能，还具有抗过敏性、降低胆固醇、降低血压、增强免疫力等诸多生理功能[1]。这些产物比未水解的蛋白质更易溶解并且水解后的氨基酸组成基本上未发生改变，酶水解多肽具有迅速给机体提供能量、无蛋白质变性、分子质量小和易溶于水等特点，蛋白质酶解有助于改善其营养价值和功能特性[2-3]。目前，国内外有许多研究者将各种蛋白在适当条件下经过酶解制备抗氧化性肽[4-7]。但是，对鱼蛋白水解物的研究很少，以鱼蛋白水解物为基料的医药品和食品几乎没有此方面的研究。

本实验通过应用碱性蛋白酶水解鲤鱼鱼肉蛋白，测定不同水解度的水解物抗氧化活性以及不同pH值条件下水解物的溶解性、乳化性和乳化稳定性以及起泡性和起泡稳定性等功能特性。旨在对鲤鱼蛋白水解物在饲料、医药和食品行业中作为天然抗氧化剂以及食品营养强化剂的应用提供一定的依据。同时，对于寻找新型高效天然抗氧化剂及进一步开发利用淡水鱼蛋白资源有重要的理论和实际意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲤鱼购于哈尔滨大润发超市，活体运至实验室，去鳞、内脏、头和骨，洗净后进行采肉(取白肉)，用搅碎机搅成肉糜。

碱性蛋白酶(Alcalase)、三吡啶三吖嗪(TPTZ)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、丁基羟基茴香醚(BHA)、邻苯二酚紫(PV)、3-(2-吡啶基)-5,6-双(4-苯磺酸)-1,2,4-三嗪(ferrozine) 美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

AL-104精密电子天平、320型pH计 上海梅特勒-托利多仪器设备有限公司；JD500-2型电子天平 沈阳龙腾电子称量仪器有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅常州国华电器有限公司；JJ-1精密增力电动搅拌器 江苏省金坛市金城国胜实验仪器厂；LG10-24A高速离心机北京医用离心机厂；UT-1800紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；LGJ-25冷冻干燥机 上海分析仪器公司；HR2860型高速组织捣碎机 珠海经济特区飞利浦家庭电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鲤鱼鱼肉蛋白水解物的制备工艺

鲤鱼肉糜→按质量比1:25的比例与水混合→均质(7000r/min，10min)→调节溶液pH值、温度至碱性蛋白酶最适条件(pH值为8.0，温度为55℃)→加蛋白酶酶解([E]/[S]＝1.5:100)→灭酶活性(90℃、5min)→离心(6000r/min，10min)→取上清液→冷冻干燥→鲤鱼鱼肉蛋白酶解产物

在反应过程中用经过稀释处理的1mol/L NaOH溶液调节样品溶液的pH值，使pH值保持恒定，反应结束后用HCl溶液调节溶液的pH值至7.0。当水解时间达到30、120min和240min时的水解度依次是5.8%、10.7%和13.3%，水解度计算参照pH-Stat法[8]。

1.3.2 鲤鱼鱼肉蛋白水解物颜色的测定

采用色差计测定水解物颜色。结果以L*、a*和b*值来表示，L*表示亮度，a*表示红度，b*表示黄度。白板的校正值为L*＝90.26，a*＝ －1.29，b*＝5.18。

1.3.3 鲤鱼鱼肉蛋白水解物抗氧化性的测定

1.3.3.1 脂肪氧化体系(liposome)的制备

采用Decker等[9]的方法，制备质量浓度为0.2mg/mL的Liposome溶液，将大豆卵磷脂溶解在0.12mol/L KCl，5mmol/L 组氨酸缓冲溶液(pH6.8)中并均质，在4℃条件下超声处理45min。对照用1mL水代替1mL样品溶液与5mL Liposome溶液混合，未水解的样品也进行同样处理。将0.1mL 50mmol/L FeCl3和0.1mL 10mmol/L 抗坏血酸盐加入Liposome体系中。样品在37℃水浴中保温1h。

1.3.3.2 硫代巴比妥酸反应物质(thiobarbituric acidreacitive substances，TBARS)的测定

参照Sinnhuber等[10]的方法。取1mL上述样品加入3mL硫代巴比妥酸溶液、17mL三氯乙酸-盐酸溶液，混匀后，沸水浴中反应30min，冷却，取反应后的样品5mL加入等体积的氯仿，3000r/min离心10min，于532nm波长处读取吸光度。TBARS值以每升脂质氧化样品溶液中丙二醛(MDA)的毫克数表示。

1.3.3.3 亚铁还原能力(ferric reducing ability of plasma，FRAP)的测定

参照Benzie等[11]的方法，取6mL新配的FRAP试剂(由30mmol/L pH3.6醋酸盐缓冲液25mL，10mmol/L TPTZ溶液2.5mL，20mmol/L FeCl3·6H2O溶液2.5mL组成)加热到37℃，向其中加入0.2mL鲤鱼鱼肉蛋白水解物，0.6mL H2O，反应10min，于593nm波长处测吸光度，以1.0mmol/L FeSO4溶液为标准品，样品抗氧化性以达到同样吸光度所需FeSO4的毫摩尔数表示。

1.3.3.4 对DPPH自由基清除能力的测定

参照Gu等[12]的方法，在反应管中加入1mL样品，再加入2mL 0.1mmol/L的DPPH-乙醇溶液，剧烈混合，黑暗条件下室温避光反应30min，于3500×g离心10min，在517nm波长处读取吸光度，对照是用蒸馏水代替样品，空白是用乙醇代替DPPH溶液。

式中：A1为样品溶液的吸光度；A2为空白溶液的吸光度；A3为对照溶液的吸光度。

1.3.3.5 金属离子螯合能力的测定

参照Saiga等[13]和Guo等[14]的方法：对Cu2＋的螯合：采用邻苯二酚紫(PV)作为Cu2＋螯合指示剂。向1mL 2mmol/L CuSO4溶液、1mL 10%吡啶、20μL 10%的PV混合物中添加1mL的鲤鱼鱼肉蛋白水解物，PV与CuSO4结合形成蓝色物质，在有螯合剂存在时PV与Cu2＋分离，溶液蓝色消失。PV溶液颜色的变化可在632nm波长处测定。

对Fe2+的螯合：1mL 20μmol/L FeCl2与1mL 0.5mmol/L Ferrozine混合后会产生一种在562nm波长处有强吸收的物质。向其中添加0.5mL的鲤鱼鱼肉蛋白水解物，由于水解物对Fe2+进行螯合，溶液颜色发生变化，在562nm波长处读取吸光度。以螯合能力表示，计算公式为：

式中：A1为样品溶液的吸光度；A2为空白溶液的吸光度。

1.3.4 鲤鱼鱼肉蛋白水解物功能特性的测定

1.3.4.1 溶解性测定

参照Tang Chuanhe[15]的方法，取10mL鲤鱼鱼肉蛋白水解液，用6mol/L HCl或6mol/L NaOH溶液调节pH值至2、3、4、5、6、7、8、9。混合物在室温下用磁力搅拌器搅拌30min，于4000r/min离心20min。上清液中蛋白质含量用Robinson等[16]方法测定。样品中总蛋白含量用凯氏定氮法测定。可溶性氮占样品总氮的百分比即为蛋白溶解度。

式中：A为上清液中蛋白含量；B为水解样品中总蛋白含量。

1.3.4.2 乳化性以及乳化稳定性的测定

参照Pearce等[17]的方法，把10mL蔬菜油和30mL 1g/100mL的蛋白质溶液混合，将pH值分别调到2、3、4、5、6、7、8。混合物用均质机在20000r/min条件下均质1min。在均质后0min和10min点从容器底部用移液管移取等量的50μL溶液，然后用5mL 0.1g/100mL的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液混合。立即用分光光度计在500nm波长处测定吸光度(A0)，并用0.1g/100mL SDS做空白。乳化稳定性为室温放置10min后再次取样的吸光度(A10)。乳化活性指数(emulsifying activity index，EAI)和乳化稳定性指数(emulsifying stability index，ESI)的计算如式(4)、(5)。

式中：m为蛋白质量/g；A0、A10为乳状液在0、10min的吸光度；ΔA＝A0－A10；Δt＝10min。

1.3.4.3 起泡性以及起泡稳定性的测定

参照Sathe等[18]的方法，取20mL 0.5g/100mL的鲤鱼鱼肉蛋白水解溶液，将pH值分别调节到2、3、4、5、6、7、8。用均质机在16000r/min均质1min后，室温条件下结合空气2min。均质后的样品要立即转移到25mL量筒中并在30s之后读取容积。起泡性按式(6)计算。

式中：V2为均质后溶液体积/mL；V1为均质前溶液体积/mL。

均质后的样品在20℃条件下放置3min后再读取容积V3。泡沫稳定性依照式(7)计算。

1.4 统计分析

每个实验重复3次，结果表示为x－±s。数据统计分析采用Stat8.1 (分析软件，St Paul，MN) 软件包中Linear Models程序进行，差异显著性(P＜0.05)分析使用Turkey HSD程序，采用Sigmaplot 9.0 软件作图。

2 结果与分析

2.1 水解物颜色的变化

表1 鲤鱼鱼肉蛋白不同水解度条件下水解物颜色的变化Table 1 Color change of hydrolysates with different hydrolysis degrees

从表1可以看出，随着水解度的增大，水解样品的L*值显著降低(P＜0.05)；而水解样品的a*值和b*值则随着水解度的增大而显著增加(P＜0.05)。

有研究[19]表明沙丁鱼和鲭鱼等深色肉鱼含有大量的容易引起氧化的肌红蛋白。鱼肉蛋白水解物的深颜色可能是由于自原材料中的肌红蛋白和黑色素的氧化形成的[20]。鱼肉蛋白水解物颜色的变化依赖于原材料的组成和水解条件，因此鲤鱼鱼肉蛋白水解物的黄色加深很可能是由于肌红蛋白和黑色素引起的。Sathivel等[21]也研究发现较高的水解温度和较长的水解时间可能引起美拉德反应，致使溶液颜色变暗，因此较高水解度的鲤鱼鱼肉蛋白水解物具有较深的颜色。

2.2 水解物抗氧化活性结果

2.2.1 TBARS值、还原能力和DPPH自由基清除能力

由于脂肪氧化后会产生MDA，所以MDA的含量高低在一定程度上反映脂质过氧化损伤的程度，MDA的含量越低则TBARS值也越低，即抑制脂肪氧化的效果越好。由图1可知，水解度为5.8%、10.7%和13.3%时的鲤鱼鱼肉蛋白水解物对脂质氧化的抑制作用随着水解度的增加而增加，与未水解样品相比差异显著(P＜0.05)。表明抗氧化多肽抑制脂质氧化的能力和水解度有关，因为鲤鱼鱼肉蛋白本身的结构使得其只有很小的抗氧化性，而酶水解后打断了这种紧密地结构，使得具有抗氧化性的活性氨基酸残基以及肽链暴露在外边，大大增强了其抗氧化能力。

图1 水解度对鲤鱼鱼肉蛋白水解物TBARS值、还原能力和DPPH自由基清除能力的影响Fig.1 Effect of DH on TBARS, reducing power (4-min FRAP value ) and DPPH radical scavenging activity of carp meat protein hydrolysates

FRAP实验是通过测定抗氧化剂的还原能力来反映其抗氧化能力的一种检验，是一种化学机制[22]。在一般情况下，物质的还原能力与抗氧化能力呈正相关。鲤鱼鱼肉蛋白肽的抗氧化能力是通过将TPTZ-Fe3+还原成TPTZ-Fe2+的能力来体现的。可以看出，鲤鱼鱼肉蛋白碱性蛋白酶水解物的FRAP值随着水解度的增加而显著增加(P＜0.05)，充分说明鲤鱼鱼肉蛋白水解物具有很强的还原能力。水解度为5.8%、10.7%和13.3%时，水解物还原能力分别是63.3、332.5μmol/L和412.1μmol/L。与未水解的鲤鱼鱼肉蛋白相比，水解物的还原能力较大。由于水解后蛋白质结构的变化使鲤鱼鱼肉蛋白水解物具有很强的还原能力，所以还原能力与水解后的蛋白结构及其肽链断裂的位置有很大关系。

碱性蛋白酶水解物对DPPH自由基的清除作用随着水解度的增大而显著增加(P＜0.05)。水解度为5.8%、10.7%和13.3%时，水解物清除DPPH自由基清除率分别是23.3%、35.3%和42.5%。未水解鲤鱼鱼肉蛋白也具有清除自由基的能力，但是清除效率低于水解物。有研究表明一些氨基酸尤其是组氨酸、酪氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸具有抗氧化能力。组氨酸的强自由基清除能力是由于其咪唑环的分解。鲤鱼鱼肉蛋白含有很高的脯氨酸、甘氨酸、亮氨酸和丙氨酸以及相对高的组氨酸、蛋氨酸和酪氨酸，水解物中可能包含有组氨酸、蛋氨酸和酪氨酸等抗氧化能力强的氨基酸残基，所以水解物的自由基清除能力可能是由于水解肽中的氨基酸引起的。结果显示鲤鱼鱼肉蛋白水解物的DPPH自由基清除率很高，即鲤鱼鱼肉蛋白水解物作为电子供体与自由基反应，终止自由基链反应。

2.2.2 水解物的金属离子螯合能力

图2 鲤鱼鱼肉蛋白水解物不同水解度对金属离子螯合能力的影响Fig.2 Effect of DH on metal chelating activity of carp meat protein hydrolysates

由图2可知，随着水解度的增大，肽段分裂程度越高，鲤鱼鱼肉蛋白碱性蛋白酶水解物对Cu2+和Fe2+的螯合作用越强。未水解的鲤鱼鱼肉蛋白对Cu2+和 Fe2+都显示出一定螯合能力，但是随着水解度的增大水解物对Cu2+的螯合作用要明显高于Fe2+(P＜0.05)。Cu2+螯合能力的上升可能是因为随着水解度的上升，释放出来的羧基含量上升，从而减少了具有氧化强化的游离Cu2+的存在[23]；而Fe2+螯合能力的上升可能是因为游离的组氨酸增加从而使得更多的组氨酸中咪唑基中氨基与Fe2+配位，从而减少了游离Fe2+的含量。

金属离子如铁离子和铜离子是非常强的自由基发生剂，能够催化各种活性氧比如羟自由基和超氧阴离子自由基的产生；金属离子的存在使得捕捉自由基的抗氧化剂失效[24]。在油脂的自氧化过程中，过渡金属离子起着非常重要的作用，微量的金属离子可使油脂氧化的诱导速率提高1036倍。因此对金属离子的螯合能力有利于抗氧化作用[13]。

2.3 水解物的功能特性

2.3.1 溶解性

图3表示不同水解度的溶液在pH2～9的范围内的溶解度变化曲线。随着水解度的增大，鲤鱼鱼肉蛋白水解物的溶解性也随之增大(P＜0.05)。在整个pH值变化范围内，溶解度的变化曲线呈现先下降后上升的趋势。在pH值为4.0时，溶解性达到最低，随后在碱性pH值范围内溶解性达到最高。

一般来说，蛋白在水解过程中肽链断裂成小肽和氨基酸，小分子肽和氨基酸容易溶解，因此伴随着水解度的增加溶解性也增加[25]。从图3可以看出，蛋白水解物的高溶解性和越来越小的组分、越来越多的亲水可溶多聚基团有关[26]。此外，在制备蛋白水解物的离心过程中能够将不溶的蛋白除去，进而加大了水解物的溶解性。碱性蛋白酶水解物的水解度越高，溶解性就越高，这与Shahidi等[27]的报告结果相一致。溶解的蛋白能够使分子均匀地分散在胶体介质中，增强界面性质，进而制造出良好感官品质的食品[28]。

图3 pH值对鲤鱼鱼肉蛋白水解物溶解性的影响Fig.3 Effect of pH on solubility of carp protein hydrolysates

2.3.2 乳化性

图4 pH值对鲤鱼鱼肉蛋白水解物乳化性(a)和乳化稳定性(b)的影响Fig.4 Effect of pH on emulsifying activity index (EAI) and emulsion stability index (ESI) of carp protein hydrolysates

由图4可知，随着水解度的增大，水解物的乳化性和乳化稳定性逐渐降低(P＜0.05)，pH值对乳化性的影响和对溶解性的影响是一致的，不同水解度的水解物在pH值为4.0时，乳化性和乳化稳定性均达到最低点。由于水解物的溶解性在pH值为4.0时最差，可能在等电点附近肽不能快速移动到表面，导致水解物的乳化性和乳化稳定性也在pH值为4.0时最差。这与水解物的乳化性和溶解性相关的报道一致[29]。

当水解度被限定时，水解物表现出特有的乳化性和乳化稳定性[30]。大分子肽或者水解肽段的含量多就有助于乳化稳定性，换句话说就是过度的水解会导致乳化性质的降低[31]。过度水解得到的小分子肽可能不是两性分子不能够显示良好的乳化性[32]。因此由于小肽的作用使得水解度越高的水解物的乳化性和乳化稳定性越低。同时，除了分子质量大小以外，其他的蛋白特性，比如：表面疏水性、弹性以及氨基酸的构成都与蛋白的乳化性具有密切的联系[33]。

2.3.3 起泡性

图5 pH值对鲤鱼鱼肉蛋白水解物起泡性(a)和起泡稳定性(b)的影响Fig.5 Effect of pH on foaming capacity and foam stability of carp protein hydrolysates

由图5可知，随着水解度的增加，起泡性和起泡稳定性的数值都下降(P＜0.05)，在较低水解度时，水解物表现出良好的起泡性和起泡稳定性。pH值对起泡性的影响和对溶解性的影响是一致的，当pH值为4.0时，水解物的起泡性和起泡稳定性最差，pH值为4.0可能是蛋白质的等电点附近值，这与Pearson[34]的报道在等电位pH值时蛋白的最低起泡性和最低溶解性相关的结果一致。

蛋白质的水解度对蛋白质的起泡性起到非常重要的作用。Shahidi等[27]报道毛鳞鱼蛋白水解物在最低水解度(12%)时呈现出良好的起泡性。进一步的水解会降低起泡稳定性，这是由于小分子肽没有能力控制泡沫的稳定性。大分子肽极有可能和蛋白质水解物的起泡稳定性相关[35]。pH值极大地影响起泡性，尤其是起泡稳定性[36]。在酸性或碱性pH值条件下起泡稳定性的减少可能是由于肽离子之间的排斥引起的，因此水解物的起泡性和起泡稳定性受到水解度和pH值的影响。

3 结 论

鲤鱼鱼肉蛋白酶解产物的抗氧化性受水解度的影响，水解度为13.3%的水解物的抗氧化性最好。随水解度的增加，水解产物的溶解性增加，而乳化性、乳化稳定性、起泡性和泡沫稳定性减小；随着pH值的变化，鲤鱼鱼肉蛋白水解产物的溶解性、乳化性和起泡性都随之变化，并在pH值为4.0时其功能性达到最低，这表明鲤鱼鱼肉蛋白水解产物的功能性质受其水解度和pH值的影响。因此，了解鲤鱼鱼肉蛋白水解产物的功能性质，可为其作为食品基料添加到食品中提供理论依据。

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Antioxidant Activity and Functional Properties of Carp Meat Protein Hydrolysates

LIU Qian，SHI Xue，KONG Bao-hua*
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Carp meat protein was hydrolyzed by alcalase to prepare hydrolysates with different hydrolysis degrees. The antioxidant activity and functional properties of the hydrolysates were investigated at various pH conditions. The results showed that inhibitory capability to lipid oxidation, DPPH radical scavenging activity, reducing power and metal chelating activity of the hydrolysates increased with the increase of DH (P＜0.05). Solubility, emulsifying activity index (EAI) and emulsion stability index (ESI), foaming capacity (FC) and foam stability (FS) of the hydrolysates reached the lowest level at pH 4.0(PI). Meanwhile, solubility, EAI and ESI increased with increasing pH (P＜0.05). However, FC and FS increased at the beginning and then decreased with increasing pH. These results demonstrated that hydrolysis could increase antioxidant activity and solubility of carp meat protein, but caused lower emulsifying and foaming activity at higher DH.

carp meat protein；hydrolysate；antioxidant activity；functional properties

TS254.1

A

1002-6630(2012)05-0019-06

2011-04-21

东北农业大学创新团队项目(CXZ011)；黑龙江省博士后基金资助经费项目(LBH-Z10244)；东北农业大学博士启动基金计划项目(2010RCB62)；黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12511054)

刘骞(1981—)，男，讲师，博士，研究方向为畜产品加工。E-mail：beetleliu@yeah.net

*通信作者：孔保华(1963—)，女，教授，博士，研究方向为畜产品加工。E-mail：kongbh@163.com