Midkine反义寡聚脱氧核苷酸对糖尿病肾病大鼠肾脏CTGF表达水平的影响

王俊伟，张丽梅，杨 慧，苑记清，任晓军，冯 凭

（1.天津医科大学总医院代谢病科，天津300052；2.天津医科大学解剖学教研室，天津 300070）

近年研究表明炎症因子在糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）的进展中起到至关重要的作用，其中结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）是促进肾脏纤维化的重要炎症因子，另有最新研究发现[1]基因敲除中期因子（midkine,MK）的小鼠能显著改善DN的进展。MK是一种肝素结合细胞因子，具有趋化炎症细胞，抗损伤和抗细胞凋亡等功能。既往对MK的研究仅局限于肿瘤、神经系统及炎症性疾病，但在DN中的作用少有报道，MK与CTGF是否存在联系尚不明确。本研究通过反义寡聚脱氧核苷酸（antisense oligodeoxynucleortides,AS-ODNs）技术抑制MK的合成，观察MK对早期DN大鼠肾脏CTGF表达水平的影响，探讨MK ASODNs在早期DN中的治疗前景。

1 材料与方法

1.1 实验动物 采用8周龄、雄性清洁级SD大鼠，体重（197±18）g，购自中国医学科学院放射医学研究所，饲养于天津医科大学动物实验中心。

1.2 实验材料 链脲佐菌素（STZ）购自美国Sigma公司；全程硫代磷酸化修饰的MKAS-ODNs购自上海生工生物公司，序列如下5′-AGGGCGAGAAGGAAGAAG-3′[2]；RNA离心柱型试剂盒购自北京百泰克公司；逆转录试剂盒购自北京全式金公司；RealtimePCRMasterMix（SYBRGreen）购自大连宝生物公司；实时荧光定量PCR引物购自北京奥科鼎盛公司。

1.3 方法 雄性清洁级SD大鼠适应性饲养1周后完全随机法分为正常组、DN组和MKAS-ODNs组各20只。DN组和MKAS-ODNs组均行单侧肾脏切除术，高糖高脂饲料饲养4周，随后尾静脉注射STZ 30mg/kg；正常组行切皮假手术，普通饲料饲养4周，尾静脉注射柠檬酸缓冲液30mg/kg。注射STZ1周采用葡萄糖氧化酶法连续监测3d随机血糖均≥16.7mmol/L作为糖尿病造模成功的标准。分别于成模后第0、3、6周监测饮水量、尿量、体重及24h尿微量白蛋白的变化，成模第6周末，MKAS-ODNs组尾静脉注射MKAS-ODNs1mg/kg[2]，正常组和DN组予等量生理盐水，干预4d后留取24h尿及肾脏组织待测。

1.4 实时荧光定量PCR 离心柱法提取总RNA，逆转录为cDNA，采用SYBRGreen嵌合荧光技术进行实时荧光定量 PCR。引物：MK-up:5′-TTCTAGCCCTTGTTGCCTTCTT-3′;MK-down:5′-ACCCATGCCGCATCCTT-3′；CTGF-up:5′-CGGGAAATGCTGTGAGGA-3′；CTGF-down：5′-TCTGGACCAG GCAGTGG-3′；GAPDH-up：5′-GTCGGTGTGAACGGATTT-3′；GAPDH-down:5′-ACTCCACGACGTAC TCAGC-3′。反应条件：预变性：95.0 ℃ 3min；变性：95.0 ℃ 10s；退火：56.7 ℃ 10s；延伸：72.0 ℃ 20s；39个循环；每个样本重复3遍。仪器自动生成CT值，GAPDH作为内参基因对样本进行校对，然后对不同组样本间的目的基因表达量进行比较，采用2-△CT 法计算。

1.5 统计学方法 数据应用统计分析软件SPSS 18.0处理，采用均数±标准差表示，组间均数比较采用单因数方差分析（ANOVA），组内两两比较采用LSD，Dunnett’s法，并进行 speraman 相关分析。统计学显著性检验水平α=0.05（双侧）。

2 结果

2.1 一般指标 成模后DN组和MKAS-ODNs组大鼠逐渐出现多饮、多尿、体重下降，毛发枯黄，精神体力差等糖尿病症状。于第6周开始出现24h尿微量白蛋白升高且与正常组比较差异有统计学意义，此时糖尿病大鼠处于早期DN阶段。处死后DN组和MKAS-ODNs组大鼠肾脏体积增大，重量增加，髓质部分空虚，测肾重体重比值较正常组明显增加，进一步证明糖尿病大鼠处于早期DN阶段（表1）。

表1 糖尿病大鼠成模后第0、3、6周时的相关指标变化Tab1 Diabe ticrats after0,3,6week sinto the mold when the changesi nrelevantin dicators（ ）

表1 糖尿病大鼠成模后第0、3、6周时的相关指标变化Tab1 Diabe ticrats after0,3,6week sinto the mold when the changesi nrelevantin dicators（ ）

3周417.56±75.33 396.08±52.24 410.69±65.58 1.010 0.398 0周358.17±60.96 434.75±37.84 424.15±47.12 6.663 0.001 0周35.17±10.34 34.65±35.85 24.15±27.12 6.663 0.001 6周494.67±78.87 409.67±56.50 462.91±72.44 4.812 0.006 3周28.67±14.58 152.50±86.96 110.00±67.55 5.673 0.002 6周56.67±88.24 227.90±101.48 119.10±90.07 9.937 0.000 0周0.11±0.04 0.12±0.05 0.15±0.02 0.95 0.960 3周0.09±0.03 1.36±1.49 1.79±1.96 1.010 0.398 6周1.90±1.03 16.61±12.56 17.32±2.85 4.812 0.006体重/kg 尿量/mL 24h尿微量白蛋白/(mmol/L) 肾重体重比值2.6±0.23 8.5±1.43 7.56±0.63 2.562 0.021 n组别20 20 20正常组DN组MKAS-ODNs组FP

2.2 实时荧光定量PCR结果 DN组大鼠肾脏组织中MK和CTGF的表达水平较正常组明显增多，差异有统计学意义（P＜0.05）；MKAS-ODNs组大鼠肾脏组织中MK和CTGF的表达水平较DN组明显减少，差异有统计学意义（P＜0.01）（表 2）。

表2 各组MK和CTGF表达水平的比较Tab2 Comparison with theexpressionlevel of MKandCTGFin eachgroup（ ）

表2 各组MK和CTGF表达水平的比较Tab2 Comparison with theexpressionlevel of MKandCTGFin eachgroup（ ）

与正常组比较#P<0.05；与DN组比较*P<0.05，**P<0.01

组别正常组DN组MKAS-ODNs组FP CTGF/（×103）0.74±0.54 216.14±143.98#0.31±0.23**16.98 0.000 MK/（×103）0.23±0.13 235.95±165.01#0.48±0.29*12.35 0.000 n 10 10 10

2.3 MK和CTGF在DN大鼠肾脏组织表达的相关性 MK和CTGF在DN大鼠肾脏组织的表达有直线相关关系，且为正相关（r=0.498，P<0.05）。

3 讨论

炎症因子与糖尿病肾病的进展密切相关，其中CTGF不仅是促进肾小管上皮细胞间质化的重要因子，还对细胞外基质的产生、积聚起重要作用[3]，是促进DN进展的重要细胞因子。既往有研究发现CTGFAS-ODNs可以有效地抑制大鼠肾间质纤维化，抑制肾小管上皮细胞间质化[4]。但是CTGF在体内多个脏器均表达，若应用反义寡聚脱氧核苷酸抑制CTGF的表达必定会影响其他脏器，而MK在成年组织中仅于肾脏和小肠表达，其他部位几乎不表达[5-6]。最新研究发现MK的表达水平和DN的进展呈正相关[7]，但MK与CTGF的相关性尚不明确。本研究通过反义寡聚脱氧核苷酸技术抑制MK的表达，发现减少MK合成可以有效地抑制CTGF的表达。

目前，反义寡聚脱氧核苷酸技术已经被广泛应用。本研究将MK作为反义治疗的靶点，首先考虑到MK基因生理情况下的表达特点：MK在胚胎上皮-间叶组织和神经组织中呈高表达，出生后MK基因的表达逐渐降低；在成年组织中，除肾脏和小肠上皮外其他部位几乎不表达。因此，笔者认为将MK作为治疗的靶点所导致的副作用最小。其次，有文献报道MK AS-ODNs在尾静脉注射后可快速地被大鼠近端小管选择性摄取并整合到近端肾小管上皮细胞中[8]，近端小管上皮细胞通过刷状缘膜ODNs结合蛋白的活动可以不衰减地有效地摄取ODNs[9-11]，本研究证实早期DN大鼠肾脏组织中MK的表达水平明显高于正常组，当予MK AS-ODNs干预4 d后MK的合成较DN组明显减少，说明通过尾静脉注射的方法可以成功地将MK AS-ODNs导入肾脏组织并发挥作用，与国外报道一致。

本研究发现MK和CTGF的表达水平呈正相关，CTGF在早期DN大鼠肾脏组织中的表达水平随着MK表达的减少而减少，说明MK AS-ODNs通过抑制MK的合成，可以降低早期DN大鼠肾脏组织CTGF的表达水平，从而阻断肾间质纤维化的进程、抵抗肾间质损伤，对于早期DN具有治疗潜能。

总之，尾静脉注射MK AS-ODNs可以降低早期DN大鼠肾脏组织MK和CTGF的表达水平，减缓肾间质纤维化进程且安全性高、副作用小。因此，我们认为MK AS-ODNs有望成为治疗DN的新靶点。

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