二次酶解法提取硫酸软骨素的工艺优化研究

陈亚，高盐生

（江苏省盐城技师学院，江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室，江苏盐城 224002）

硫酸软骨素（Chondroitin Sulfate，简称 CS）是存在于动物软骨组织中的多种酸性多糖的混合物，主要通过共价键与核心蛋白质相连，以蛋白聚糖的形式存在[1-2]。CS具有降血脂、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、调节免疫等多种药理活性，在医药、保健食品、美容化妆品等领域应用广泛[3]。作为我国重要的天然生化药物资源，CS除了满足国内市场需要外，还是我国生化药物的第三大出口产品，仅次于氨基酸和肝素钠，年出口总量达3 700 t。随着各国对CS产品质量标准的提高，国际上对高纯度CS的需求趋于旺盛，市场前景看好[4]。

目前，CS主要是从动物的软骨组织中提取获得，提取方法有碱法、碱盐法、酶法、超声波法和乙酸抽提法等，国内较多采用碱提—酶解—醇沉的方法制备CS[5]，该工艺中酶解的主要目的是利用蛋白酶水解蛋白质的特异性，使软骨中的胶原蛋白和黏性蛋白等蛋白质水解成多肽或氨基酸，再根据氨基酸与CS在某些溶剂中的溶解性差异，实现CS与其它杂质的分离，从而提高CS的纯度，因此酶解是CS提取中的关键环节，酶解效果直接关系到CS的得率和品质[6]。通常情况下，酶解工艺所用酶多为专一性较低的蛋白酶，比如胰酶[5，7]、木瓜蛋白酶[8]、碱性蛋白酶[9]等，但由于酶作用的特异性，导致其对蛋白质的水解不充分，产品纯度不高。因而有学者采用由多种酶组成的复合酶对原料进行酶解以提高CS的提取效果[2，10]，但由于不同酶的最佳作用条件的差异，酶解工艺条件较难把握。本研究以猪喉软骨为原料，通过碱提-酶解-醇沉的方法制备CS，并采用二次酶解法对酶解这一直接影响CS品质的关键步骤开展优化研究，为工业生产提供有价值的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜猪喉软骨：市售。

胰酶和中性蛋白酶：上海蓝季科技发展有限公司；盐酸氨基葡萄糖：南通双林生物制品公司；其他试剂，国产分析纯。

1.2 仪器与设备

FA1604型电子天平：上海上天精密仪器有限公司；PHS-3C型实验室pH计：上海精密科学仪器有限公司；722型可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水多用真空泵：巩义予华仪器有限责任公司；KYC-100C空气恒温摇床：上海福玛实验设备有限公司。

1.3 提取工艺与方法

1.3.1 工艺流程

采用改进的碱提—酶解—醇沉的工艺流程：原料预处理→碱液提取→酶解Ⅰ（胰酶）→酶解Ⅱ（中性蛋白酶）→沉淀干燥→CS产品。与传统工艺相比，本研究采用二次酶解的方法，即经胰酶水解后的产物再利用中性蛋白酶进一步酶解。

上述工艺中的原料预处理、去除杂质、沉淀干燥等实验方法参考相关文献[2，5]；碱液提取、酶解Ⅰ的工艺经前期的优化研究，碱液提取的最佳工艺为碱液浓度 10.0%、料液比 1∶1.6（g/mL）、提取时间 3.9 h、提取温度40.0℃，胰酶酶解的最佳工艺为胰酶浓度1.0%、pH8.6、酶解温度46℃、酶解时间2.8 h（详细结果将另文报道）；本文重点对酶解Ⅱ环节进行优化研究。

1.3.2 中性蛋白酶酶解的工艺优化

胰酶酶解产物用2 mol/L的HCl调pH至7.0左右，加入中性蛋白酶进行二次酶解。根据影响酶促反应的因素，以CS纯度和产率为分析指标，分别对酶解过程中的酶浓度、pH、酶解温度、酶解时间进行单因素影响的实验，筛选单因素的最佳条件。

1.3.3 产品检测

CS产率计算：CS产率=提取的CS质量/供试猪软骨质量×100%；

CS纯度检测，根据《中华人民共和国卫生部药品标准》，以氨基葡萄糖含量为CS纯度指标，采用Elson-Morgan法测定氨基葡萄糖含量[11]——样品经盐酸水解生成氨基葡萄糖，然后在碱性条件下与乙酸丙酮反应，生成色原物质，再与对二甲氨基苯甲醛反应产生红色，以盐酸氨基葡萄糖标准液为对照品，分光光度法测定其吸光度，进而换算出氨基葡萄糖含量[11-12]。

2 结果与分析

由于软骨中的CS与蛋白质多糖结合成复合物，制备CS时，需通过酶将蛋白质水解成多肽或氨基酸，从而将CS释放出来。但由于酶能水解的肽键有一定的特异性，释放出的CS仍可能连接多个氨基酸残基或多肽，在后续纯化中很难除去。如用一步酶解法，CS含氮量难以降低，纯度难以提高，所以为了提高CS的纯度，可以选择不同的酶进行二次酶解。本研究在传统的碱提—酶解—醇沉工艺的基础上，采用二次酶解法，以提高CS的提取效果，并在前期对碱液提取和第一步酶解工艺优化的基础上，就中性蛋白酶的二次酶解工艺进行优化研究。

2.1 酶浓度的影响

为了探讨不同中性蛋白酶浓度对产品产率及其氨基葡萄糖含量的影响，研究中分别采用浓度为0.5%、0.7%、0.9%、1.1%、1.3%、1.5%的中性蛋白酶溶液进行酶解，酶解温度45℃、pH 7.0，酶解时间为2 h，结果如图1所示。

由图1可见，酶浓度对CS产率的影响不明显；但对CS纯度的影响较大，其氨基葡萄糖含量随酶浓度的提高呈上升趋势，在酶浓度1.1%时达到33.21%，此时的CS产率为17.51%。继续提高酶浓度，氨基葡萄糖含量不再明显上升。故1.1%为最佳的酶浓度。

2.2 酶解温度的影响

选取酶浓度为1.1%，酶解温度分别为40、42、44、46、48、50 ℃，pH 7.0，酶解时间为 2 h，考察酶解温度的影响结果如图2所示。

由图2可知，CS产率在17.50%附近小幅变动，受酶解温度的影响不明显；而CS中氨基葡萄糖含量随酶解温度的上升先升高后下降，当酶解温度为44℃时，氨基葡萄糖含量达最大值32.87%，此时的CS产率17.62%。所以44℃为最佳的酶解温度。

2.3 pH的影响

采用酶浓度为1.1%，酶解温度为44℃，分别选取pH 为 6.4、6.7、7.0、7.3、7.6、7.9，酶解时间为 2 h，考察pH对CS产率和氨基葡萄糖含量的影响，结果如图3所示。

pH对氨基葡萄糖含量的影响较大，在所设计的试验条件范围内，氨基葡萄糖含量随pH升高而明显上升，在pH7.0时达到最大值，继续增大pH，氨基葡萄糖含量迅速下降；而pH对CS产率影响不大。故7.0为最适pH，此时的氨基葡萄糖含量32.75%，CS产率17.71%。

2.4 酶解时间的影响

当酶浓度1.1%，酶解温度44℃，pH7.0，酶解时间分别为 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h 时，考察酶解时间的影响，结果如图4所示。在所设计的试验条件范围内，随着酶解时间的延长，CS产率变化不明显，而氨基葡萄糖含量缓慢上升，在酶解时间2.0h后，氨基葡萄糖含量不再明显上升。故结合设备利用率、酶解成本等因素的考虑，选择2.0h作为较好的酶解时间。

采用上述优化的酶解条件（酶浓度1.1%、酶解温度44℃、pH7.0、酶解时间2.0 h），对经胰酶酶解的产物用中性蛋白酶进行二次酶解，产物经乙醇沉淀干燥，得到CS产品的产率为17.65%，其氨基葡萄糖含量达33.59%。与只经一次酶解比较，CS产率无明显变化，但氨基葡萄糖含量提高了7.65%。表明二次酶解可以有效提高CS产品的纯度和质量，满足市场对高品质CS的需求。

3 结论

1）以新鲜猪喉软骨为原料制备CS。在传统的碱提—酶解—醇沉的基础上，采用中性蛋白酶对原料进行二次酶解，并对其工艺条件进行优化研究，得到二次酶解的最佳条件为酶浓度1.1%、酶解温度44℃、pH7.0、酶解时间 2.0 h。

2）研究结果表明，一次酶解得到的产物经二次酶解能增加CS中氨基葡萄糖含量7.65%，可以有效提高CS产品的纯度和质量，满足医药等领域对高品质CS的需求。

3）本研究对更好地利用生猪加工的副产品——猪喉软骨，做到资源的合理和充分利用；以及为现有CS生产企业改进生产工艺，提高产品质量和经济效益提供了参考。

：

[1]户业丽,蔡焕焕,程波,等.人工养殖鲟鱼头中硫酸软骨素的提取工艺[J].食品研究与开发,2010,31(4):115-118

[2]吴枫楠.碱-酶法提取硫酸软骨素的工艺研究[J].食品与生物技术学报,2010,20(1):81-83

[3]刘武.硫酸软骨素药理作用研究进展[J].中国药业,2008,17(8):64-66

[4]张志斌.硫酸软骨素生产新酶解法工艺[J].河南化工,2010,27(4):98

[5]许永安,陈守平,苏金华,等.史氏鲟鱼硫酸软骨素的提取及抗肿瘤活性的研究[J].上海海洋大学学报,2010,19(4):553-559

[6]王安,刘靓,刘敏尧,等.硫酸软骨素提取用酶的现状及前景[J].食品研究与开发,2011,32(4):182-183

[7]徐传屯,关瑞章,郑江,等.养殖鲟鱼软骨中硫酸软骨素的优化提取工艺研究[J].中国生化药物杂志,2009,30(3):154-161

[8]熊双丽,李安林,吴照民,等.鸡胸软骨硫酸软骨素的提取及分离纯化[J].农业工程学报,2009,25(1):271-275

[9]刘安军,王慧,朱振元,等.鲟鱼硫酸软骨素提取工艺的研究[J].现代食品科技,2009,25(6):617-619

[10]舒坤贤,张继承,袁帅,等.中华鲟硫酸软骨素提取工艺研究[J].食品工业科技,2006,27(3):151-153

[11]中华人民共和国卫生部.WS-10001-(HD-0892)-98中华人民共和国卫生部药品标准二部第六册:生化药品第一分册[S].北京:化学工业出版社,1998:138-139

[12]伍茂云,谢书伸,冉蓉,等.硫酸软骨素光度分析方法的改进[J].四川大学学报,工程科学版,2000,32(3):101-102