银杏内酯B对高胆固醇诱导的PC12细胞胆固醇含量的影响*

郭茂娟，范英昌，卢 斌，姜希娟△

(天津中医药大学1病理三级实验室，2病理教研室，天津 300193)

越来越多的研究认为外周胆固醇升高会上调脑胆固醇水平，进而导致神经元结构受损、功能降低，诱发阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)，有研究甚至认为胆固醇代谢紊乱是AD病理生理的核心［1］。因此，调节神经元胆固醇代谢是防治AD的新思路。PC12细胞是一种常用的神经细胞株，来源于大鼠肾上腺髓质分泌儿茶酚胺的嗜铬细胞瘤(一种交感神经系统的肿瘤)，其胞质内含有大量嗜铬颗粒，富含合成及分解多巴胺所需的酶，具有神经分泌细胞和神经元的性质，且增殖能力强。因此，PC12细胞被广泛用于代替神经元进行研究［2－3］。

近年来银杏叶提取物被广泛用于防治AD，取得了较好疗效，然而其作用机制尚未完全阐明。我们前期研究发现银杏叶所含单体银杏内酯B(ginkgolide B，GB)可以有效降低离体培养神经元胆固醇含量，提示调节脑胆固醇可能是其防治AD的作用机制之一。然而，机体外周与中枢之间存在完整的血脑屏障(blood－brain barrier，BBB)，绝大多数物质无法自由通过。因此，离体单独干预神经元的效果，很难在体重现。为了验证BBB存在时GB能否同样干预神经元胆固醇含量，本研究利用Transwell装置，将星形胶质细胞(astrocyte，Ast)和脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells，BMECs)共培养，模拟在体BBB环境，在此环境下观察GB对高胆固醇条件下PC12细胞胆固醇含量的影响，揭示GB防治AD的潜在作用机制。

材料和方法

1 细胞

PC12细胞株(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤，购于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，CCTCC)。

2 药品及试剂

DMEM培养基(Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，马血清(Gibco)，多聚－L－赖氨酸(Sigma)，MTT试剂盒(购自北京中西泰安技术服务有限公司)，可溶性胆固醇(Sigma)，血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和辛伐他汀均购自Sigma，GB标准品购自宝鸡贝斯特植物原料有限公司。其余试剂均为市售分析纯。

3 仪器

CO2培养箱(Sanyo)，超净化工作台(日立)，Leica倒置显微镜，酶标仪(Lab systems)，高效液相色谱仪(Varian Prostar 210)，高压泵(Prostar 210)，反相色谱柱(ZORBAX Eclipse XDB －C184.6 ×250 mm，5 μm，Agilent)，紫外检测器(Varian Prostar 325)，色谱数据处理系统(LC Work－station V6.2)。

4 方法

4.1 原代脑微血管内皮细胞的培养 选取2周龄的SD大鼠，脱臼处死，消毒后分离出大脑皮质，DMEM培养液漂洗后，将其剪碎、匀浆，再加入0.1%Ⅱ型胶原酶37℃水浴消化30 min，离心、弃上清。加入20%牛血清白蛋白悬浮混匀后离心，加入2 mL 0.1%胶原酶/分散酶悬浮混匀后37℃水浴消化30 min，离心、弃上清，再次加入20%BSA悬浮混匀后离心，即可获得底部黄白色的“微血管层”。吸取出底部“微血管层”，加入DMEM离心2次，弃上清，加入脑微血管内皮细胞培养液(DMEM高糖，20%胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺，1 g/L肝素，1 μg/L碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，10 μg/L 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，悬浮后接种于涂有明胶的塑料培养瓶中，第2代用于本实验。

4.2 原代星形胶质细胞的培养与纯化 新生2～3 d Wistar大鼠，脱臼处死，消毒后，取脑，解剖显微镜下剥除脑膜，取两侧大脑皮质，D－Hanks液洗2次，剪碎后，0.125%胰酶液37℃消化10 min，终止消化，轻轻吹打，滤网过滤后，1000 r/min离心5 min，加入含20%胎牛血清的DMEM培养基混悬沉淀，接种入培养瓶中，CO2培养箱中培养60 min后取出，轻轻翻转培养瓶，吸取上清液种植于另一预先涂有L－多聚赖氨酸的培养瓶中，放入培养箱中继续培养。培养7～10 d待细胞分层生长后，置于37℃摇床中250 r/min振荡24 h，弃上清液，D－Hanks液洗3次，加入0.25%胰酶消化，终止消化后，细胞悬液1000 r/min离心5 min，弃上清，加入含20%胎牛血清的DMEM培养基混悬沉淀，接种入预先涂有L－多聚赖氨酸的培养瓶中继续培养，第2代用于本实验。

4.3 PC12培养方法 PC12细胞株培养于含10%胎牛血清、10%灭活马血清和1%双抗(链霉素和青霉素)的DMEM培养基中。在5%CO2、37℃的培养箱内培养，2～3 d更换培养液1次，细胞融合度达70% ～80%时，用弯头吸管适力吹打至细胞大部分脱落，800 r/min离心5 min，弃上清，完全培养基重悬，1∶3传代，实验均取对数生长期细胞。

4.4 PC12细胞胆固醇损伤模型建立 收集对数生长期细胞，用完全培养基重悬计数，以5×105/cm2的密度种于事先用L－多聚赖氨酸包被的6孔板中。待细胞密度达到70%～80%时，将培养有内皮细胞和星形胶质细胞的Transwell(孔径0.45 μm)建成体外BBB模型，并置于培养有PC12细胞的6孔板内。在Transwell内皮细胞侧加入含40 μmol/L终浓度可溶性胆固醇的培养基继续作用24 h，作为高胆固醇损伤细胞模型(3种细胞的种植方式见图1)。

Figure 1.Transwell device for BBB model.BMECs:brain microvascular endothelial cells;Ast:astrocytes;PC12:PC12 cells.图1 Transwell装置示体外BBB模型示意图

4.5 实验分组及干预 对照组(N)，普通培养基培养;模型组(M)，40 μmol/L胆固醇处理24 h，更换正常培养基继续培养16 h;西药对照组(S)，40 μmol/L胆固醇处理24 h，更换含5 μmol/L辛伐他汀的培养基继续培养16 h;银杏内酯B中剂量组(GB－M)40 μmol/L胆固醇处理24 h，更换含MTT测量的最佳剂量GB的培养基继续培养16 h;银杏内酯B高剂量组(GB－H)，GB用量为5倍于中剂量组，其余同GB－M组;银杏内酯B低剂量组(GB－L)，GB用量为中剂量组的1/5，其余同GB－M组。(注:胆固醇加在Transwell内皮细胞侧，模拟机体外周胆固醇作用于BBB模型后，进而作用于PC12细胞。)

4.6 MTT比色法确定药物剂量 将 PC12细胞以1×105/cm2密度种植于96孔板，待细胞密度达到70% ～80%时，加入含40 μmol/L胆固醇的完全培养基作用24 h，然后，更换含有梯度浓度银杏内酯B的完全培养基作用16 h。弃上清，无色D－Hanks清洗2～3遍，置换无血清、无酚红的含0.5 g/L MTT的无色培养基，每孔100 μL，培养箱中作用4 h，弃上清，每孔加入100 μL DMSO作用10 min，充分振荡后570 nm比色。

4.7 采用高效液相色谱法(high－performance liquid chromatography，HPLC)检测神经元胆固醇含量

4.7.1 细胞内液收集 待细胞处理结束后，弃去培养基，PBS洗3遍。吹打后收集细胞，将每孔收获好的细胞用220 μL裂解液裂解，3000 r/min离心5 min，取上清液用于细胞内胆固醇测定。另将收获的细胞用220 μL裂解液裂解，3000 r/min离心5 min，为样品，用BCA法测定蛋白含量。上清液中加入等体积的新鲜配制的15%KOH醇溶液，室温涡旋至细胞溶解产物清亮，加入6%的三氯乙酸去蛋白。再加入等体积的正己烷∶异丙醇4∶1溶液(V/V)，将混合物涡旋5 min，然后1500 r/min离心5 min。收集上层有机相。将下层水相按上述方法重复抽提2次。将混合的有机相在真空冷冻干燥机中65℃干燥，在室温冷却后，加入100 μL异丙醇∶正庚烷∶乙腈35∶12∶52(V/V)，将样本溶解，活性碳去色素，超声除气5 min，1500 r/min 离心 5 min，收集上清液，取 10 μL进样，进行高效液相色谱分析。

4.7.2 标准曲线的绘制 精密量取 200、100、20、10、5 mg/L的胆固醇标准溶液各200 μL，加入50 μL 100 mg/L的豆甾醇内标液(标准溶液和内标溶液都用乙醇配制)，混匀，加0.3 mL水、0.5 mL乙醇、1 mL正己烷，混匀 15 min;取有机相500 μL，50℃挥发干燥，加入0.4 mL丙酮－硫酸－三氧化铬溶液，反应衍生5 min，加入0.5 mL正己烷终止反应，加0.5 mL 水，混匀15 min，取300 μL 挥发干燥，加300 μL 流动相溶解，进样 10 μL。

4.7.3 总胆固醇的测定 取10 μL进行蛋白定量，定量后，样本再进行高效液相色谱分析。使用安捷伦HP1100高效液相色谱仪，采用Hypersil1 C18柱，以异丙醇∶乙睛=20∶80为流动相进行非梯度洗脱，流速1 mL/min，柱温20℃，DAD检测波长250 nm。按步骤绘制标准曲线，以胆固醇峰和内标峰面积之比与胆固醇浓度进行线性回归，以回归方程计算所测样品总胆固醇浓度。

5 统计学处理

采用SPSS 16.0软件包先进行数据正态性检验，数据以均数±标准差()表示，运用单因素方差分析统计法。方差齐性检验P＜0.05，表明方差不齐，进行两两比较时选用Tamhane's T2检验，如果方差齐性检验P＞0.05，则选用LSD检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 形态学观察

倒置相差显微镜下观察发现PC12细胞接种6 h后可见细胞呈单层聚集生长，大多细胞呈圆形、短梭形或三角形，胞浆伸展，细胞两极有短突起，细胞折光性好，胞核可见。随时间的延长，72 h细胞成堆聚集生长明显，细胞间没有空隙，贴壁较松，随密度的增大可见重叠生长及悬浮生长，见图2。

Figure 2.Cultured PC12 cells under microscope(×100).图2 体外培养的PC12细胞

2 MTT比色实验选择GB的给药浓度

参照文献用药资料设定大致浓度范围后，采用MTT法检测细胞活力，选定最佳A值作为中剂量组浓度，采用其1/5剂量作为低剂量组浓度，采用其5倍剂量作为高剂量组浓度。GB浓度为5 μmol/L时A值最高，见表1，故本实验选定GB的干预剂量为:低剂量 1 μmol/L，中剂量 5 μmol/L，高剂量25 μmol/L。

表1 梯度浓度GB对PC12细胞活力的影响Table 1.The effect of different concentrations of GB on PC12 cell viability(.n=8)

表1 梯度浓度GB对PC12细胞活力的影响Table 1.The effect of different concentrations of GB on PC12 cell viability(.n=8)

*P ＜0.05 vs GB 0 μmol/L group.

0.308 ±0.0701.25 0.329 ±0.0602.5 0.346 ±0.05050.422 ±0.09010 0.422 ±0.030*20 0.420 ±0.040*40 0.418 ±0.05080 0.417 ±0.0300*

3 高效液相色谱法检测PC12细胞胆固醇的含量

采用高效液相色谱法检测不同干预条件下PC12细胞内胆固醇含量，结果显示培养基内加入40 μmol/L可溶性胆固醇后，PC12细胞内胆固醇含量升高，与对照组相比差异显著(P ＜0.01)。将不同浓度银杏内酯 B(1 μmol/L、5 μmol/L 和25 μmol/L)加入上述模型中，处理16 h后发现25 μmol/L GB降胆固醇的效果最佳，与模型组相比差异显著(P＜0.05)，与阳性对照药辛伐他汀组比较没有显著差异(P＞0.05)，见表2。

表2 高胆固醇环境下PC12细胞胆固醇变化及GB的影响Table 2.The effects of GB and simvastatin on intracellular cholesterol content in PC12 cells exposed to high cholesterol()

表2 高胆固醇环境下PC12细胞胆固醇变化及GB的影响Table 2.The effects of GB and simvastatin on intracellular cholesterol content in PC12 cells exposed to high cholesterol()

*P ＜0.05 vs control;＊＊P ＜0.01 vs high cholesterol.

Group n Cholesterol(g/g protein)Control 8 2.29 ±0.26＊＊High cholesterol 8 3.67 ±0.43 High cholesterol+simvastatin 8 2.96 ±0.40*High cholesterol+GB 1 μmol/L 8 3.49 ±0.67 High cholesterol+GB 5 μmol/L 8 3.37 ±0.89 High cholesterol+GB 25 μmol/L 7 3.00 ±0.53*

讨 论

胆固醇参与合成激素、构成细胞生物膜，是人体不可或缺的重要成分。适量胆固醇是脑组织合成激素和神经递质，维持脑细胞正常结构和功能的物质基础。然而，脑胆固醇含量过高也会导致神经元结构受损，功能降低，导致AD等疾病发生［4－6］。胆固醇代谢与AD发病机制的深入研究为治疗和预防AD药物的开发提供了一个新的方向。

从细胞和分子水平系统、深入研究AD需要建立良好的AD体外模型。以往的研究常采用单独原代培养的神经元建立模型，该模型虽具代表性和特异性，但因培养系统不稳定，实验周期长而使其应用受到一定限制。PC12细胞因具有神经元的特性，且增殖能力强，细胞特性稳定，而被广泛用于代替神经元进行研究。另外，单独培养的神经元无法体现外周与中枢存在血脑屏障的生理环境。利用Transwell装置将脑血管内皮细胞和星形胶质细胞共培养则解决了体外血脑屏障的问题。本研究中发现BBB模型建立后，跨膜细胞电阻(TEER)可以达到312～340 Ω/cm2时(本文未显示)，提示模型建立成功，符合体外BBB标准。

我们前期实验显示GB能够有效降低高胆固醇环境下PC12细胞的胆固醇含量，但是基于BBB背景下，外周高胆固醇作用于该模型后，GB对PC12细胞是否还具有保护作用?因此，本实验在前期实验基础上，利用40 μmol/L终浓度的可溶性胆固醇作用于BBB，成功复制PC12高胆固醇损伤模型，比较接近在体的内环境，且实验条件易于控制，是体外进行AD 研究的理想模型［3，7－8］。

在银杏内酯中，银杏内酯B的生理活性最强，是迄今发现的最强的血小板活化因子拮抗剂，同时对损伤神经元具有保护作用［9］。德国产的银杏叶提取物——金纳多已经用于临床治疗多种疾病，对神经元保护作用目前颇受重视［10－11］，且临床证实对AD患者有一定疗效，故该实验采用银杏内酯B作为干预药物。阳性对照药物选择辛伐他汀，作为羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶竞争性抑制剂，抑制羟甲基戊二酸单酰辅酶A形成，限制胆固醇合成。

本实验主要采用高效液相色谱法检测了不同干预条件下PC12细胞内胆固醇含量，结果显示培养基内加入高浓度可溶性胆固醇后，细胞内胆固醇含量升高，提示胆固醇升高可以影响脑胆固醇含量。梯度浓度的银杏内酯B干预上述模型后，可以不同程度地影响神经元胆固醇含量，其中以高剂量组效果最佳，显示了一定程度的剂量依赖性。提示调节脑胆固醇含量可能是银杏内酯B防治AD的机制之一，为其防治AD提供了实验依据。

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