乙肝免疫球蛋白不能阻断乙肝病毒感染人绒毛膜癌细胞*

甘 露，肖小敏△，魏 明

(1暨南大学附属第一医院妇产科，广东 广州 510632;2西安医学院基础医学部，陕西 西安 710021)

我国是乙型肝炎的流行病区。在围生期和婴幼儿时期感染乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)者中，分别有90%和25% ～30%将发展成慢性感染［1］，其成年后发生肝硬化甚至肝癌的几率明显增加，因此阻断HBV宫内传播已成为围产医学和传染病学亟待解决的问题。目前产前阻断HBV母婴传播的方法是在孕晚期应用乙肝免疫球蛋白(hepatitis B immunoglobulin，HBIG)，但临床上对其效果尚存在争议。胎盘是病毒宫内传播发生的关键部位，胎盘屏障的第一层细胞是滋养层细胞，滋养细胞被广泛用作病毒宫内传播的靶细胞。来源于胎盘滋养层的绒毛癌细胞，与滋养层细胞特性功能基本相似。BeWo和JAR细胞，作为已建立的绒毛癌细胞系，目前被广泛用作代表胎盘屏障的滋养层细胞模型［2－4］。因此本实验使用不同浓度的 HBIG(103、102、10、1、0.1 IU/L)作用于HBV感染的人绒毛膜癌细胞系JAR细胞，探讨其在体外阻断HBV感染JAR细胞的作用。

材料和方法

1 细胞来源

以源于滋养层细胞的人绒毛膜癌细胞系JAR细胞作为滋养细胞模型，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

2 主要试剂

HBV血清为2009年收集的乙肝患者HBV阳性血清，ELISA检测乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)、乙肝 e 抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)、乙肝核心抗体(hepatitis B core antibody，anti－HBc)均为阳性，经荧光定量PCR检测血清HBV－DNA滴度为5×1011copies/L，无合并甲、丙、丁、戊肝的实验室依据，使用前用无血清 RPMI－1640，1∶5 稀释，并通过0.22 μm 孔径滤器过滤除菌，分装，置于－80℃保存。阴性血清为体检正常人的外周血血清，同上处理。HBIG购自四川远大蜀阳药业有限公司;RPMI－1640细胞培养基和胎牛血清购自Gibco;鼠抗人HBsAg单克隆抗体(Ⅰ抗)、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记羊抗鼠Ⅱ抗购自北京中杉金桥生物工程公司;人类基因组DNA提取和纯化试剂盒:Biospin Cell Genomic DNA Extraction Kit(离心柱型，Cat:BSC0531)购自BioFlux;乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒(Cat.#DA－D051)购自中山大学达安基因股份有限公司;其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

3 主要方法

3.1 MTT比色法 检测不同浓度的HBIG(终浓度分别为 103IU/L、102IU/L、10 IU/L、1 IU/L、0.1 IU/L)对JAR细胞的作用。取适量用细胞计数板进行计数。调整细胞浓度至108/L，取100 μL接种至96孔板，每孔细胞数约为104个，每组6孔。将96孔板放回CO2培养箱继续培养，待细胞长到板面积70%，分别加入不同浓度的HBIG，阴性对照组不加HBIG，空白对照孔不加细胞，只加培养基。置于37℃、5%CO2恒温培养箱中。培养24 h，于24 h后每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，37℃继续孵育4 h后，吸弃孔内培养基，每孔加入 DMSO 150 μL，振荡10 min，在酶标仪上选择测定波长570 nm，参照波长为630 nm，测定各孔吸光度(A值)。各组A值=各组测得的A值－空白组A值均值。

3.2 细胞内DNA提取及荧光定量PCR检测HBV－DNA HBV血清感染体外培养的JAR细胞，不同浓度的 HBIG(终浓度为 103、102、10、1、0.1 IU/L)干预，24 h后采用BioFlux公司人类基因组DNA提取和纯化试剂盒提取、纯化细胞内DNA，按试剂盒操作。采用中山大学达安基因股份有限公司HBV核酸扩增荧光定量检测试剂盒进行HBV－DNA检测，按试剂盒操作。

3.3 细胞免疫荧光染色法 制作细胞爬片，待细胞长满片的50%，加入HBV阳性血清孵育，24 h后取出细胞爬片，PBS洗5 min共12次。室温下，4%多聚甲醛固定20 min;用PBS洗5 min共3次;0.3%Triton X－100室温处理5 min;PBS洗，10 min共3次;山羊封闭血清室温封闭1 h，不洗;加入1∶50稀释的鼠抗人HBsAg单克隆抗体(Ⅰ抗)，4℃过夜;PBS洗10 min，共3次;加入1∶100稀释FITC标记的Ⅱ抗，37℃避光孵育1 h;PBS洗10 min，共3次;加入DAPI，室温避光孵育5 min;PBS洗5 min，共2次;甘油封片，4℃避光保存30 min;激光共聚焦显微镜下观察染色结果。

4 统计学处理

用SPSS 13.0统计软件进行分析。数据用均数±标准差()表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较用SNK检验或Tamhane's T2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 MTT结果

各浓度HBIG组的A值与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，说明此次设定的各个浓度的HBIG对JAR细胞的生长无显著影响，见表1。

表1 不同浓度HBIG对JAR细胞生长作用Table 1.The growth of JAR cells in different groups(.n=6)

表1 不同浓度HBIG对JAR细胞生长作用Table 1.The growth of JAR cells in different groups(.n=6)

HBIG 103IU/L 0.56 ±0.16 HBIG 102IU/L 0.58 ±0.16 HBIG 10 IU/L 0.54 ±0.11 HBIG 1 IU/L 0.56 ±0.12 HBIG 0.1 IU/L 0.52 ±0.11 Negative control 0.56 ±0.14

2 实时荧光定量PCR结果

以不同浓度HBIG培养的各组细胞内均检测到HBV－DNA的存在，但各组之间的HBV－DNA拷贝数没有显著差异(P＞0.05)。阴性对照组和空白对照组均为阴性，见表2。

3 免疫细胞荧光染色法

通过激光共聚焦显微镜，在JAR细胞胞质内检测到HBsAg免疫反应阳性物质(绿色)，呈片状或团块状分布。特别的是在细胞核的边上HBsAg免疫反应阳性物质呈点状分布，且荧光较强，如戒指结构。在第1组到第6组各组中，无论加入HBIG终浓度的高低，均可在JAR细胞胞质内检测到HBsAg免疫反应阳性物质，见图1。随机抽取10个不同视野，进行拍照。每个视野圈定10个以上的细胞。利用软件对圈定的每个细胞进行荧光灰度分析。各实验组与阴性对照组比较，细胞内HBsAg荧光强度差异有统计学意义(P＜0.05);各实验组与空白对照组比较，细胞内HBsAg荧光强度差异有统计学意义(P＜0.05);各实验组之间比较，细胞内HBsAg荧光强度差异无显著(P ＞ 0.05)，见表3。

表2 不同组JAR细胞内HBV－DNA拷贝数Table 2.The copies of HBV－DNA in JAR cells in different groups(.n=4)

表2 不同组JAR细胞内HBV－DNA拷贝数Table 2.The copies of HBV－DNA in JAR cells in different groups(.n=4)

aThe numbers were logarithmically transformed.P ＞0.f05.

Group HBV－DNA copiesa HBV+HBIG 103IU/L 4.80 ±0.56 HBV+HBIG 102IU/L 5.00 ±0.62 HBV+HBIG 10 IU/L 5.00 ±0.54 HBV+HBIG 1 IU/L 5.10 ±0.83 HBV+HBIG 0.1 IU/L 4.89 ±0.65 HBV 5.04 ±0.70 Negative control ＜3 Blank control ＜3

讨 论

目前临床尚对孕晚期应用HBIG阻断HBV宫内传播的效果尚存在争议。一部分研究者认为孕晚期使用HBIG对阻断HBV母婴传播有效［5］。而一部分学者认为新生儿出生后常规主被动免疫，已经能阻断大部分的HBV母婴传播，孕晚期使用HBIG性价比不高，甚至是没有阻断效果。张平等［6］按使用HBIG情况分组观察使用效果，发现孕期使用HBIG对阻断宫内感染无效。朱科伦等［7］对HBV阳性孕妇于孕28周后每月接种HBIG 200 IU，定期检测孕妇血HBsAg、HBV－DNA和 HBsAb，发现 HBsAg和HBV－DNA无明显降低，HBsAb无明显升高，认为HBV阳性孕妇孕期注射的HBIG剂量尚未能完全中和孕妇血清中的HBV，HBIG中和病毒的作用和效果尚值得怀疑。

Figure 1.The localization of HBsAg was examined by laser scanning confocal microscopy(×400).HBsAg(green)was found in JAR cells in the test groups.HBsAg was located in the cytoplasm or at the edge of the nucleus(blue).a1－c1:HBV+103IU/L HBIG;a2－c2:HBV+102IU/L HBIG;a3－c3:HBV+10 IU/L HBIG;a4－c4:HBV+1 IU/L HBIG;a5－c5:HBV+0.1 IU/L HBIG;a6－c6:HBV;a7－c7:blank control(fetal bovine serum);a8－c8:negative control(healthy people serum).图1 激光共聚焦显微镜检测HBsAg的定位

表3 不同组JAR细胞内HBsAg荧光强度Table 3.The HBsAg expression in JAR cells in different groups(.n=100)

表3 不同组JAR细胞内HBsAg荧光强度Table 3.The HBsAg expression in JAR cells in different groups(.n=100)

*P ＜0.05 vs HBV group.

Group Fluorescent intensity HBV+HBIG 103IU/L 583.14 ±116.85 HBV+HBIG 102IU/L 581.90 ±69.13 HBV+HBIG 10 IU/L 582.26 ±107.46 HBV+HBIG 1 IU/L 576.24 ±118.22 HBV+HBIG 0.1 IU/L 583.79 ±118.56 HBV 615.28 ±134.59 Negative control 275.91 ±48.26*Blank control 295.43 ±44.50*

针对孕晚期使用HBIG的争议，HBV病毒血清体外感染细胞的可能性，我们采用高病毒载量的HBV－DNA阳性血清感染体外培养的JAR细胞，模拟母胎界面，应用不同浓度的HBIG去干预，检测细胞内的HBV－DNA拷贝数的差异。HBV－DNA阳性直接反应了病毒的复制水平，同时也提示宿主具有传染性。目前，临床上认为HBIG浓度至少达到10 IU/L才有保护作用［8］。因此本次实验设定5个HBIG 的浓度，分别为 103、102、10、1、0.1 IU/L。其中前2个浓度高于最低保护浓度，后2个浓度低于最低保护浓度。同时设立阴性对照组(正常人血清)和空白对照组(胎牛血清)。

首先，采用MTT法检测各浓度HBIG对JAR细胞生长的影响，结果利用单因素方差分析得出P＞0.05，说明本次实验设定的各浓度的HBIG对JAR细胞生长的差异无显著。可以进行后续实验。在与HBV阳性血清共同孵24 h后提取JAR细胞内的DNA，采用实时荧光定量PCR检测HBV－DNA的拷贝数，得出各组细胞内均检测到HBV－DNA的存在，但各组之间的HBV－DNA的拷贝数没有显著差异。阴性对照组和空白对照组均为阴性。

实时荧光定量PCR结果提示，较高浓度的HBIG组(终浓度为103IU/L和终浓度为102IU/L)的JAR细胞内的HBV－DNA拷贝数与第6组(只加病毒)的JAR细胞内的HBV－DNA拷贝数相比无显著差异;激光共聚焦显微镜结果也提示这2组细胞内HB-sAg荧光强度与第6组相比无显著差异。这说明在体外条件下高于最低保护浓度的10倍、100倍浓度的抗体也并不能阻断HBV感染JAR细胞。

Partovi等［9］用非房室模型计算肌注HBIG的药代动力学参数，如果肌注HBIG的患者抗HBs滴度300 IU/L可以3周后再注射，如果滴度在200～300 IU/L之间3周内注射，滴度在151～200 IU/L之间2周注射，滴度在100～151 IU/L需1周内注射，而滴度小于100 IU/L应立即注射。对于HBsAg滴度较高者注射HBIG后，由于中和作用，抗HBs滴度将较快降低而难以维持在有效浓度。此研究提示若不管HBsAg、HBeAg和HBV－DNA浓度的差别，一律于孕晚期注射3次HBIG 200 IU可能是不合理的。

而孙玉革等［10］对慢性携带HBV的孕妇于孕晚期注射HBIG 200或400 IU。动态观察结果显示，无论在注射后24 h、72 h、1周、2周、4周，还是3次注射结束后l周，HBV－DNA水平和注射前比较均无下降趋势，无显著差异(均P＞0.05)。此研究说明注射小剂量HBIG后的各个时段都不会对HBVDNA水平产生影响，注射HBIG前后HBV标志物无变化，更无anti－HBs检出。

结合我们的实验，高于临床最低保护浓度的抗体并不能阻断HBV感染JAR细胞。因此，我们认为目前在临床上孕晚期应用200 IU HBIG直接阻断乙肝病毒感染滋养细胞的途径值得怀疑，孕期应用HBIG是否还能通过其它途径阻断宫内HBV传播则有待进一步研究。

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