柴胡皂苷在体外对人白血病细胞株K562/ADM多药耐药性的逆转作用*

盖晓东，历 春，李 倩，刘艳波，薛昊罡

(北华大学基础医学院，吉林 吉林 132013)

多药耐药(multidrug resistance，MDR)是肿瘤化疗失败及肿瘤复发的重要原因。迄今至少已发现13种与MDR相关的ATP结合盒转运体，P－糖蛋白(p－glycoprotein，P－gp)是其中最重要的一员［1］。维拉帕米、环孢霉素等常见的耐药逆转剂，由于正常血药浓度难以达到疗效或存在明显的不良反应而在应用上受到限制。目前国内中药广泛应用于肿瘤的临床治疗，其中提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性是临床使用中药的一个重要目的。目前已发现多种中药有着较好的逆转MDR作用，其可能的机制与抑制MDR蛋白的活性、影响MDR基因的表达、促进耐药性肿瘤细胞的凋亡等有关［2－3］。柴胡为我国传统中药，具有解表和里、疏肝解郁等功效，其粗提物具有逆转肿瘤细胞MDR的作用［4］。我们在预实验中对从柴胡中提取出的多糖(Bupleurum chinese polysaccharides，BCPS)、皂苷(Saikoside，SS)等多种组分进行筛选，结果发现SS具有MDR逆转作用，本实验针对SS对K562/ADM细胞MDR的逆转作用以及初步逆转机制进行了研究，探索该药在抗人白血病MDR方面的应用价值。

材料和方法

1 材料

IMDM培养基为Gibco产品。四甲基偶氮唑［3－(4，5－dimethylthiazol－2 －yl)－2，5－diphenyl－tetrazolium bromide，MTT］、二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)为 Sigma产品。维拉帕米(verapamil，VER)为上海市禾丰制药有限公司产品。盐酸多柔比星(又称阿霉素，adriamycin，ADM)为浙江省海正药业股份有限公司产品。超级新生牛血清为上海依科赛生物制品有限公司产品。Annexin V－FITC细胞凋亡检测试剂盒为凯基公司产品。北柴胡(市售，经鉴定为正品北柴胡)。K562细胞和 K562/ADM细胞由吉林大学再生研究所提供。酶标仪(Tecan Genios)。流式细胞仪(Beckman)。

2 方法

2.1 柴胡皂苷提取 将柴胡在40～50℃的烘箱中烘7～8 h，充分干燥后，用植物粉碎机将其粉碎，取柴胡粉末100 g。加入70%乙醇500 mL，60℃下，回流提取2 h，抽滤，滤渣反复提取3次，减压旋转蒸发回收溶剂，得到浸膏，适量蒸馏水使其充分溶解后，加入水饱和正丁醇反复萃取3次。萃取液经55℃减压旋转蒸发除大部分溶剂后，于80℃烘箱中彻底烘干，磨碎后得到棕褐色柴胡总皂苷粉末2.8 g，收率为2.8%。

2.2 MTT法检测SS的药物毒性作用 分别取对数生长期的K562和K562/ADM细胞(1×108/L)，接种在96孔板内，实验组加入不同浓度的SS(1～100 mg/L)，对照组加入等体积的培养基不加药物。5%CO2、37 ℃培养48 h，每孔加入15 μL MTT，继续培养4 h。2000 r/min离心5 min，倾去培养液，每孔加入150 μL DMSO，振荡 10 min，酶标仪测定 A570值，每组各设3个平行孔。确定对K562/ADM细胞抑制率≤10%的药物浓度为SS的非细胞毒性剂量。抑制率=1－(对照孔A值－实验孔A值/对照孔A值)×100%。

2.3 MTT法检测SS对K562/ADM细胞逆转作用取对数生长期K562/ADM细胞(1×108/L)接种在96孔板内，选用SS非细胞毒性剂量以下浓度1.25、2.5、5.0 mg/L和阳性对照VER 5 mg/L分别与不同浓度ADM(0.05～100 mg/L)联合作用于K562/ADM细胞。方法同2.2测定A570值，每组各设3个平行孔。计算各组的50%抑制浓度(50%inhibitory concentration，IC50)，求出SS作用后的逆转指数(reversal index，RI)，RI=耐药细胞逆转前的 IC50/耐药细胞逆转后的IC50。

计算2种药物A、B相互作用系数(coefficient of drug interaction，CDI)，CDI=AB/(A × B)，A 为 A 药物单独作用与对照组的比值，B为B药物单独作用与对照组的比值，AB为两药共同作用与对照组的比值。CDI＜1，两药具有协同作用;CDI＜0.07，两药物具有明显的协同作用［5－6］。

2.4 流式细胞术检测细胞内ADM浓度 为了更有效检测细胞内ADM浓度，我们使用的ADM浓度为50 mg/L，是ADM对K562/ADM细胞的 IC50。取对数生长期的K562/ADM细胞(4×108/L)接种在6孔板内，实验分组如下:(1)K562/ADM;(2)K562/ADM+ADM 50 mg/L;(3)K562/ADM+ADM 50 mg/L+VER 5 mg/L;(4)K562/ADM+ADM 50 mg/L+SS 5 mg/L;(5)K562/ADM+ADM 50 mg/L+SS 2.5 mg/L;(6)K562/ADM+ADM 50 mg/L+SS 1.25 mg/L。5%CO2、37℃培养4 h，收集细胞，PBS洗2遍，依据ADM本身发荧光的特点，用流式细胞仪测定荧光强度(激发波长488 nm、发射波长575 nm)。

2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 ADM对细胞凋亡影响具有时间和剂量依赖性，50 mg/L ADM作用24 h细胞碎片较多，因此选择10 mg/L ADM。取对数生长期 K562/ADM(4×108/L)接种6孔板中，每孔1 mL。实验分组如下:(1)K562/ADM;(2)K562/ADM+ADM(10mg/L)+SS(1.25、2.5 和5 mg/L);(3)K562/ADM+ADM(10 mg/L)+VER(5 mg/L)。5%CO2、37℃培养24 h，收集细胞于EP管中，PBS洗1次，采用Annexin V和PI双染法在流式细胞仪上检测细胞凋亡(激发波长488 nm、发射波长575 nm)。

2.6 流式细胞术检测细胞周期 取对数生长期K562/ADM细胞(4×108/L)接种6孔板中，每孔1 mL，待细胞贴壁后，实验分组如下:(1)K562/ADM;(2)K562/ADM+ADM(50 mg/L);(3)K562/ADM+ADM(50 mg/L)+VER(5 mg/L);(4)K562/ADM+ADM(50 mg/L)+SS(1.25、2.5 和 5 mg/L)。5%CO2、37℃培养4 h，收集细胞，70%乙醇4℃过夜，PBS洗2次，流式细胞仪检测细胞周期(激发波长488 nm、发射波长575 nm)。

3 统计学处理

采用SPSS 11.0软件进行统计处理，数据用均数±标准差()表示，多样本间均数比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计意义。

结 果

1 SS对K562和K562/ADM细胞的毒性作用

SS(1～100 mg/L)6个浓度作用48 h后，随着浓度的增加，K562和K562/ADM细胞的增殖抑制率也相应增加，呈剂量－效应关系，见图1。SS对K562/ADM细胞的非细胞毒性剂量为5.0 mg/L，抑制率＜10%。因此，选择SS非细胞毒性剂量以下的浓度作为最佳药物逆转浓度。SS对K562和K562/ADM细胞的IC50值分别为9.25 mg/L和29.9 mg/L。

Figure 1.Inhibitory rates of the proliferation of K562 and K562/ADM cells after treated with SS.图1 SS作用下K562和K562/ADM细胞的增殖抑制率

2 SS对K562/ADM细胞MDR的逆转作用

SS的非细胞毒性剂量为5.0 mg/L，取1.25 mg/L、2.5 mg/L和5.0 mg/L与不同浓度的ADM(0.05～100 mg/L)联合作用于K562/ADM细胞进行逆转作用研究，测定IC50。从表1可以看出3个浓度的SS与不同浓度ADM的联合作用均可使K562/ADM的IC50明显下降，呈现剂量依赖性，与逆转前IC50比较均有显著差异(P＜0.01)。其中以5.0 mg/L SS逆转效果最佳，逆转指数达到21.5倍，而阳性逆转剂VER的逆转倍数为13.5倍。

表1 SS与ADM联合作用下K562/ADM细胞株耐药性的逆转指数Table 1.Reversal index(RI)of K562/ADM cells after treated with SS and ADM(.n=3)

表1 SS与ADM联合作用下K562/ADM细胞株耐药性的逆转指数Table 1.Reversal index(RI)of K562/ADM cells after treated with SS and ADM(.n=3)

*P ＜0.05 vs ADM group.

ADM 0 49.53 ±3.10—13.5 ADM+SS 1.25 5.93 ±0.12* 8.42.5 4.98 ±0.13* 10.05.0 2.31 ±0.36* 21.5 ADM+VER 5.0 3.67 ±0.33*

3 SS与ADM的协同作用

经计算，SS浓度为1.25、2.5和5.0 mg/L各组的CDI值分别为0.92、0.89和0.82，均 ＜1，表明 SS与ADM具有协同作用。

倒置显微镜下观察细胞形态，SS协同ADM作用后，肿瘤细胞除了增殖受到抑制外，也出现了大量凋亡细胞，表现为细胞胞浆浓缩、体积缩小、核碎裂呈小块，呈剂量－效应关系，见图2。

Figure 2.The morphology of K562/ADM cells after treated with different concentrations of SS and ADM for 48 h.A:K562/ADM;B:SS 1.25 mg/L+ADM 5 mg/L;C:SS 2.5 mg/L+ADM 5 mg/L;D:SS 5 mg/L+ADM 5 mg/L.图2 不同浓度的SS与ADM作用K562/ADM细胞48 h后的形态

4 SS作用下K562/ADM细胞内ADM浓度的变化

不同浓度非细胞毒性剂量SS联合ADM分别作用于K562/ADM细胞4 h后，随着SS浓度的增加K562/ADM细胞内ADM荧光强度相应增加，与ADM单独作用的K562/ADM细胞比较差异显著(P＜0.05)，阳性对照VER也可明显增加K562/ADM细胞内ADM荧光强度(P＜0.05)。而不同浓度非细胞毒性剂量SS联合ADM作用于K562细胞后，各组细胞内ADM荧光强度与ADM单独作用的K562细胞比较无明显差异(P＞0.05)，见表2。提示SS可增加K562/ADM细胞内ADM的蓄积。

5 SS对K562/ADM细胞凋亡的影响

在不同浓度的非细胞毒性剂量SS联合ADM作用K562/ADM细胞24 h后，各组细胞凋亡率与单用ADM组相比均明显增加(P＜0.05)，可见非细胞毒性剂量SS能够增强ADM对K562/ADM细胞的凋亡诱导作用，见图3。

6 SS作用下细胞周期时相分布的变化

ADM单独作用于K562/ADM细胞4 h后与对照组相比，G0/G1期细胞明显增加，S期细胞明显减少(P＜0.05)。当ADM分别与不同浓度的非细胞毒性剂量SS作用K562/ADM细胞4 h后，各组细胞与ADM单独作用比较G0/G1期细胞均明显增加，S期细胞明显减少(P＜0.05)，表明SS具有增加ADM作用于K562/ADM细胞的G0/G1期增殖阻滞作用，见表3。

表2 SS与ADM联合作用下K562/ADM细胞内ADM浓度的变化Table 2.The changes of ADM level in K562/ADM cells after treated with SS and ADM(.n=3)

表2 SS与ADM联合作用下K562/ADM细胞内ADM浓度的变化Table 2.The changes of ADM level in K562/ADM cells after treated with SS and ADM(.n=3)

*P ＜0.05 vs ADM group(K562/ADM).

Group K562/ADM K56256.20 ±3.89 ADM 22.80 ±2.39 50.70 ±2.67 ADM+SS 1.25 mg/L 31.90 ±2.04* 54.30 ±2.122.5 mg/L 35.20 ±1.98* 53.10 ±1.895.0 mg/L 38.50 ±2.56* 53.90 ±2.92 ADM+VER 46.70 ±2.24*

Figure 3.The apoptosis of K562/ADM after treated with SS and ADM.1:K562/ADM+ADM 10 mg/L;2:K562/ADM+ADM 10 mg/L+VER 5 mg/L;3:K562/ADM+ADM 10 mg/L+SS 1.25 mg/L;4:K562/ADM+ADM 10 mg/L+SS 2.5 mg/L;5:K562/ADM+ADM 10 mg/L+SS 5 mg/L.*P ＜0.05 vs group 1.图3 SS联合ADM对K562/ADM细胞凋亡的影响

表3 SS联合ADM作用下K562/ADM细胞细胞周期变化Table 3.The changes of cell cycle of K562/ADM cells after treated with SS and ADM(%..n=3)

表3 SS联合ADM作用下K562/ADM细胞细胞周期变化Table 3.The changes of cell cycle of K562/ADM cells after treated with SS and ADM(%..n=3)

*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs ADM group.

Group G0/G1S Control 24.80 ±5.64 72.30 ±2.98 ADM 32.90 ±3.29* 61.50 ±3.65*ADM+SS 1.25 mg/L 41.50 ±3.94*# 52.10 ±4.77*#2.5 mg/L 49.60 ±4.67*# 46.60 ±3.95*#5.0 mg/L 55.70 ±5.28*# 34.20 ±5.74*#ADM+VER 49.60 ±4.76*# 42.30 ±4.21*#

讨 论

白血病MDR是白血病化疗的一大障碍，克服白血病MDR，提高抗癌药物疗效已经成为白血病治疗亟待解决的关键性课题。体外被证实具有逆转耐药活性的化合物或生物制剂有很多，如环胞霉素、异博定等，但因它们对心、肾的毒性，使其临床应用受到限制。研究白血病MDR，寻找有效低毒的逆转剂，一直是人们感兴趣的研究课题。

自从Tsuruo等［7］报道异搏定具有逆转肿瘤多药耐药以来，相继发现了数种化疗药物逆转剂，特别是钙通道阻滞剂(calcium channel blocker，CCB)药物逆转效果最为可靠，但化学药物因本身的毒副作用限制其临床应用。柴胡具有和解泄热、疏肝解郁和抗肿瘤等作用，其粗提物具有逆转肿瘤细胞多药耐药的作用［4］。SS是从柴胡中提取的有效活性成分，毒性小，非毒剂量的SS 1.25、2.5和5 mg/L能够增强K562/ADM细胞对ADM的敏感性，使其对ADM的IC50明显下降，逆转倍数分别为8.4倍、10.0倍和21.5倍，表明SS能部分逆转K562/ADM细胞的耐药性。细胞形态观察也证实了非毒剂量的SS协同ADM作用后，肿瘤细胞除了增殖受到抑制外，也出现了大量的凋亡细胞。同时CDI值分别为0.92、0.89和0.82，均小于1。表明SS与ADM具有协同作用。

因ADM能自发荧光，细胞内ADM荧光强度与细胞内ADM浓度呈正相关，即荧光强度可以反映细胞内ADM浓度［8］。本研究结果显示:SS联合ADM作用K562/ADM细胞后，细胞内的荧光强度明显提高，提示SS可以增加K562/ADM细胞中ADM的蓄积。MDR的形成机制错综复杂，包括经典耐药标志蛋白P－gp、细胞周期调控异常、凋亡基因表达失控及DNA 修复能力增强等因素［9－10］。

研究表明，肿瘤细胞获得MDR主要的机制之一就是通过逃逸凋亡或拮抗凋亡而获得的。因此，诱导MDR肿瘤细胞凋亡，可为肿瘤治疗提供新的靶点［11－13］。我们的研究也证实了 SS可以使 ADM 作用下的K562/ADM细胞凋亡率明显增加，从而提高K562/ADM细胞对ADM敏感性，逆转肿瘤细胞的MDR。细胞周期实验结果显示，SS处理后G0/G1期细胞明显增加，G2/M期的分裂受到了抑制。G1期为细胞分化期，也是药物作用的敏感期，提示SS逆转作用可能是通过将K562/ADM细胞阻滞在G0/G1期而发挥作用。

综上所述，SS对K562/ADM细胞具有一定的增殖抑制和逆转作用，其逆转作用可能是通过增加细胞内化疗药物的蓄积，诱导细胞凋亡和将 K562/ADM细胞阻滞在G0/G1期从而抑制其增殖，其它相关逆转机制有待进一步研究。

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